Тпмпк что это такое: Процедура прохождения ТПМПК — Центр психолого‑педагогической, медицинской и социальной помощи Василеостровского района Санкт‑Петербурга

Содержание

Управление образования, опеки и попечительства администрации Козульского района

Информация о материале
Просмотров: 3392

О деятельности Службы консультативной помощи родителям (законным представителям) по вопросам развития и образования детей

Территориальная психолого-медико-педагогическая комиссия —

Управления образования опеки и попечительства администрации Козульского райрна   (ТПМПК) создана в целях своевременного выявления детей с особенностями в физическом и (или) психическом развитии и (или) отклонениями в поведении, проведения их комплексного психолого-медико-педагогического обследования (далее – обследование) и подготовки по результатам обследования рекомендаций по оказанию им психолого-медико-педагогической помощи и организации их обучения и воспитания, а также подтверждения, уточнения или изменения ранее данных рекомендаций.

  • ТПМПК осуществляет свою деятельность на постоянной основе.
  • Инициатором обращения в ТПМПК могут быть;
  • —   родители (законные представители) ребенка;
  • — образовательные организации, организации, осуществляющие социальное обслуживание, медицинские организации, другие организации с письменного согласия родителей (законных представителей) ребенка.
  • ТПМПК – это команда специалистов, в своем заключении формулирующих:
  • —   обоснованные выводы о наличии либо отсутствии у ребенка особенностей в физическом и (или) психическом развитии и (или) отклонений в поведении и наличии либо отсутствии необходимости создания условий для получения ребенком образования, коррекции нарушений развития и социальной адаптации на основе специальных педагогических подходов;
  • —  рекомендации по определению формы получения образования, образовательной программы, которую ребенок может освоить, форм и методов психолого-медико-педагогической помощи, созданию специальных условий для получения образования.
  • Обследование детейпроводится каждым специалистом комиссии индивидуально или несколькими специалистами одновременно. Состав специалистов комиссии, участвующих в проведении обследования, процедура и продолжительность обследования определяются исходя из задач обследования, а также возрастных, психофизических и иных индивидуальных особенностей детей.
  • Обследование детей, консультирование детей и их родителей (законных представителей) специалистами комиссии осуществляется бесплатно.
  • Обследование детей проводится в помещениях, где размещается комиссия. При необходимости и наличии соответствующих условий обследование детей может быть проведено по месту их проживания и (или) обучения.
  • Заключение комиссии носит для родителей (законных представителей) детей рекомендательный характер.
  • Информацияполученная в ходе работы с ребёнком и его семьёй является конфиденциальной и не может использоваться во вред правам и законным интересам ребёнка.
     
  • Ребенок до 18 летприходит на комиссию в сопровождении родителя (законного представителя)

График работы ТПМПК Козульского района .

 

п.п.

Вид деятельности

Ответственный специалист

Время проведения

1.

Проведение обследования детей, консультации специалистов ТПМПК

Руководитель ТПМПК

По предварительной записи

2.

Заседание ТПМПК, выдача коллегиальных заключений

Руководитель ТПМПК

По предварительной записи, еженедельно

по средам с 14.00

Консультирование, запись на ТПМПК может осуществляться по телефонам:                                   

                                                                                                — 8 (39154) 2-19-70

                                                                                                — 8-983-153-07-08

Е-mail: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript.

Адрес сайта :http://kozulkauoop.ru/

ТПМПК

КАК ПОДГОТОВИТЬ РЕБЕНКА К ОБСЛЕДОВАНИЮ ТПМПК

             За несколько дней до обследования в непринужденной форме вспомните с ребенком домашний адрес, сведения о родителях (ФИО, где и кем работают), знакомое стихотворение (по возрасту), поговорите о текущем времени года.

           Создайте у ребенка позитивный настрой на обследование (не говорите, что пойдете на комиссию, что там будут проверять знания ребенка и т.д.)

           Настраивайте дошкольника на игровую деятельность, а школьника на общение с педагогом-психологом.

          Не переживайте сами за результаты и процесс обследования. Помните, что Ваша тревога передается ребенку.

          В день заседания комиссии ребенок должен быть здоровым. В случае, если ребенок заболел, позвоните по телефону 8(39168)46355 и попросите перенести обследование на другой день.

          Во время обследования не подсказывайте ребенку, не отвлекайте его замечаниями и репликами. При необходимости помощь ребенку окажет психолог.

         При ребенке не произносите фразы «он стесняется», «он не любит учить стихи, рассказывать», «он это не умеет», «он при посторонних людях не отвечает» и т.п.

         После комиссии обязательно похвалите ребенка, даже если он отвечал не так, как Вы ожидали.

Памятки Федерального ресурсного центра ПМПК

1. Маршрутизатор по прохождению процедуры ПМПК с детьми разных возрастных групп
2. Вы узнали, что у ребенка аутизм: 8 советов родителям
3. «Чем занять малыша?»
4. Растим здоровым малыша
5. Возможные варианты включения ребёнка с особенностями развития в образовательные организации
6. Выбор маршрута образования детей с ОВЗ и инвалидностью

7. Особенные дети: обучение по новому стандарту
8. Трудности в развитии ребенка: где получить помощь?
9. Выпускник с ОВЗ и инвалидностью: выбор профессиональной траектории

Нормативные документы

1. Постановление администрации города Бородино Красноярского края от 01.10.2019 № 636 «Об утверждении Порядка работы территориальной психолого-медико-педагогической комиссии»

2. Приказ Отдела образования администрации города Бородино от 23.09.2021 № 01-02-80а «О внесении изменений в Приказ № 01-02-16 от 11.02.2020 года «Об утверждении состава психолого-медико-педагогической комиссии»

3. Режим работы ТПМПК

4. Документы для представления ребенка на ТПМПК

5. График заседаний ТПМПК на ноябрь 2021

6. Организация работы ТПМПК

Консультация для родителей. Психолого — медико

Консультация для родителей. Психолого — медико — педагогическая комиссия (ПМПК). Что это такое и как подготовить ребенка?

Что такое ПМПК?

ПМПК — это комиссия, на которой происходит комплексная диагностика ребенка разными специалистами на наличие диагнозов (как правило, умственная отсталость, ЗПР и др.) и определение возможности или невозможности обучения в общеобразовательной школе и переводе в коррекционную школу или обратно в обычную.

На обследование ПМПК направляют как дошкольников, так и детей школьного возраста, как правило, учеников 1-4 классов, потому что в этом возрасте уже становится понятно, есть ли у ребенка непреодолимые препятствия к обучению в обычной школе или нет.

Направляет на комиссию обычно школа (учитель, завучи) или сами родители, когда считают, что ребенку нужно обучаться в учреждении другого типа. Читайте, Стоит ли отдавать ребенка в коррекционную школу?

Как проходит обследование на ПМПК?

На комиссию в заранее оговоренный день приглашаются родители с ребенком. Обычно заседание комиссии происходит в одном кабинете, где ребенок попадает в руки сразу нескольких специалистов. В комиссию входят: психиатр, психолог, логопед, дефектолог, учитель, родители.

Все специалисты могут сидеть как за одним столом, и ребенок стоит (сидит) перед ними, или же специалисты сидят за разными столами, и ребенок подходит к ним по очереди. Они задают вопросы идают задания. Стоит сказать, что сама форма проведения ПМПК некомфортна для ребенка: врачи зачастую не подбадривают его, торопят, не дают передохнуть. По времени обследование занимает примерно час-два. Родителям важно успокоить ребенка, поддержать, а в случае резких вопросов или озвучивания диагнозов защитить. На комиссию нужно взять с собой поесть и попить.

Подготовка ребенка к  прохождению ПМПК

Идя на комиссию, ребенок должен знать, в какой форме с ним будут работать, и быть к этому готовым. Вопросы ПМПК зависят от возраста ребенка и проверяемых диагнозов.

Что спрашивают на ПМПК?

  • Рассказать о себе, своих родных и друзьях: как зовут, где живут, где работают, какой возраст. Рассказать о своих занятиях и занятиях своих друзей: что делают с друзьями вместе? Что делают вместе с мамой/папой? Как проводят время. Имена учителей и воспитателей. Сведения о домашних питомцах: клички, питание, уход и т.д. О доме, где живет: сколько комнат, для чего они предназначены, для чего предназначены кухня, ванная.

  • Рассказать об окружающем мире: утро-ночь, выходные-будни, обед-ужин,  распорядок дня, отличия. Ребенок должен ориентироваться в понятиях: больше – меньше, длиннее – короче, живое – неживое, Должен знать цвета, формы предметов, их расположение (на столе, под столом и т.д.).

  • Проверяют умение обобщать и логику. Ребенок должен объединять предметы по признаку (суп, помидоры, конфеты — еда). Выбрать лишний предмет из нескольких и объяснить, почему. Для чего нужны предметы, что с помощью них делают. Знать части тела и их предназначение. Какие бывают профессии.

  • Проверяют память: называют на слух слова и просят повторить, раскладывают картинки или предметы, потом перекладывают и просят объяснить, что изменилось.

  • Проверяют речь ребенка: правильно ли строит предложения, все ли звуки произносит, правильно ли меняет окончания слов в зависимости от рода существительных, времени глаголов. Просят назвать или объяснить значения, привести примеры:

    • синонимы (слова, близкие по значению, например, счастливый – радостный)

    • антонимы (противоположные по значению, например, горячий – холодный)

    • омонимы (слова, имеющие несколько значений, например, ручка, коса, ключ).

А также просят назвать звуки слова, сколько слов в предложении. Оценивают, понимает ли ребенок разницу между словами, близкими по звучанию (бочка – почка). Просят составить небольшой рассказ по картинкам. Проверяют понимание устной речи, говорят несколько предложений и просят пересказать или ответить на вопросы.

  • Просят показать какое-то действие: как ты рисуешь, как ты идешь домой.

  • Проверяют умение рассказать о своих желаниях (хочет есть, в туалет и т.д.), чувствах (усталость, радость).

  • Проверяют координацию движений и развитие моторики: поймать мяч, пнуть, встать на одну ногу и т.д.

То есть вполне обычные для ребенка предшкольного или школьного возраста вопросы и способы диагностики. Но здесь важно понять, почему ребенок не справился с заданием: переволновался или это связано с другими причинами. Ребенку с неродным русским языком или педагогически запущенному ребенку трудно дать синонимы слова или объяснить пословицы, но это не означает, что ребенок не способен обучаться.

Готовить к ПМПК можно, чтобы не волновался, чтобы знал типы заданий и чего от него примерно будут ждать. Но все вопросы, повторимся, обычные, то есть обычный ребенок, с которым занимаются и которого развивают, сможет ответить на эти вопросы.

Результаты ПМПК

По итогам обследования комиссия готовит протокол ПМПК, с которым должны ознакомиться родители под роспись. Подпись на протоколе ставится как подтверждение факта прохождения комиссии в присутствии родителей (законных представителей).

В отчете ПМПК будет содержаться рекомендации родителям:

  • Сможет ли ребенок обучаться в обычной школе.

  • Рекомендовано ли обучение в коррекционной школе.

  • Нужны ли ребенку дополнительные учебные занятия, занятия с логопедом, лечение и наблюдение у врачей и психологов.

Заключение комиссии ПМПК носит рекомендательный характер, родители не обязаны следовать этим рекомендациям.

ТПМПК

Родительская категория: Сведения об образовательной организации Категория: Территориальная психолого-медико-педагогическая коммисия

Территориальная психолого-медико-педагогическая комиссия

Все мы хотим видеть своих детей успешными и счастливыми. Но иногда радость родительства омрачается пониманием того, что наш ребенок развивается по-своему, особому образовательному маршруту. Ему требуется больше времени для выполнения заданий, он быстро устает, с трудом запоминает, не успевает в учебе за своими сверстниками. Мы расстраиваемся, заставляем ребенка больше заниматься, обвиняем его в лени, запрещаем общаться с друзьями.

А ведь решение проблемы есть – достаточно своевременно выявить проблемы ребенка, подобрать необходимого специалиста и вместе с родителями правильно определить условия дальнейшей работы с ребенком.

ТПМПК определяет специальные потребности ребенка, используя комплексную диагностику его психофизического развития. Это помогает подобрать индивидуальный образовательный маршрут и лучшие условия для его развития.

 

ТПМПК:

  • осуществляет комплексную диагностику психофизического развития ребенка;
  • даёт информацию об отдельных образовательных организациях, реализующих АООП и специализированные образовательные услуги для детей с ОВЗ и детей-инвалидов;
  • оказывает методическую помощь территориальным ПМПК Томской области, консилиумам образовательных учреждений.

 

Показания к направлению ребенка или самостоятельному обращению родителей со своим ребенком в ТПМПК:

  • длительность и выраженные трудности периода адаптации к условиям детского учреждения, детского коллектива;
  • наличие любых речевых нарушений;
  • отставание в развитии общей и мелкой моторики;
  • подозрение на снижение зрения и слуха;
  • повышенная эмоциональная возбудимость, агрессивность и другие проявления этого ряда;
  • трудности формирования и автоматизации учебных навыков, умений и знаний соответственно образовательным стандартам, характерным для конкретного возрастного этапа развития;
  • утрированные проявления двигательной расторможенности и нарушений внимания, общие проблемы произвольной регуляции деятельности;
  • подозрение на отставание ребенка в интеллектуальном развитии.

 

 Вся информация, полученная во время обследования, является строго конфиденциальной и сообщается только родителям (законным представителям) ребёнка.

Обследование детей и оказание консультативной помощи осуществляется БЕСПЛАТНО

 

Состав ТПМПК:

 

Руководитель

Гореница Анастасия Михайловна

Секретарь

Вотинцева Анна Викторовна

Педагог – психолог

Родченко Наталия Викторовна

Учитель — дефектолог

Дробышева Марина Александровна

Учитель – логопед

Нерусова Галина Николаевна

Врач – психиатр

Двойных Наталья Сергеевна

Врач – педиатр

Кузнецова Наталья Артёмовна

 

Адрес места нахождения ТПМПК и проведения комиссий

Деятельность ТПМПК осуществляется на базе МБУ ДО «Детско-юношеский центр»: Томская область, город Колпашево, ул.Комсомольская, д.9, кабинет № 19 (2 этаж)

Контактный телефон

8 (38254) 4-20-42

График приёма документов для прохождения ТПМПК

Кабинет № 17

Каждая среда с 9.00 до 13.00

Каждая пятница с 14.00 до 17.00

График проведения ТПМПК

Каждый четверг с 14.00 (кроме праздничных)

Электронная почта

Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

 

Резервный состав ТПМПК:

 

Педагог – психолог

Шенднелева Дарья Сергеевна

Учитель — логопед

Куралару Марина Владимировна

Врач – психиатр

Монгуш Ия Александровна

Врач — педиатр

Ковальчук Екатерина Валерьевна

 

 

 

 

Управление образования — Сведения о ПМПК

Приветствую Вас, Гость · RSS10.04.2022, 19:35

 

Заведующий ПМПК:  Киселева Татьяна Юрьевна

Контакты: 663491, г. Кодинск, ул. Колесниченко, 10

Тел./факс  РУО  (39143) 2 – 12 – 24,   ПМПК   2-21-52

Е-mail: [email protected]; kodinskpmpk72@mail.ru 

Объявление!!!!

Деятельность ТПМПК

Отчет ТПМПК за 2019-2020 уч.год

Отчет ТПМПК за 2020 год

ЗДРАВТВУЙТЕ!

специалисты территориальной психолого-медико-педагогической комиссии

рады приветствовать Вас на нашей страничке!

 

Территориальная психолого-медико-педагогическая комиссия Управления образования администрации Кежемского района (ТПМПК) создана в целях своевременного выявления детей с особенностями в физическом и (или) психическом развитии и(или) отклонениями в поведении, проведение их комплексного психолого-медико-педагогического обследования (далее- обследование) и подготовки по результатам обследования рекомендаций по оказанию им психолого- медико-педагогической помощи и организации их обучения и воспитания, а также подтверждения, уточнения или изменения ранее данных рекомендаций.

 

ТПМПК опирается на принципы:

  • семейно-центрированности:

при обследовании специалисты взаимодействуют не только с ребенком,

но и с законными представителями ребёнка;

при обследовании специалисты устанавливают партнерские отношения с ребенком и его законными представителями;

  • междисциплинарного взаимодействия:

обследование осуществляется специалистами психолого-педагогического и медицинского профиля, действующих в рамках технологии профессионального взаимодействия;

  • добровольности и открытости:

обследование носит заявительный характер обращения от законных представителей ребёнка, обеспокоенных его развитием;

  • конфиденциальности:

информация о ребенке и семье, доступная специалистам, не подлежит разглашению;

  • профессиональной ответственности:

специалисты ответственны за принятие решения и рекомендации,

которые затрагивают интересы ребенка.

  • доступности информирования:

законным представителям ребёнка предоставляется доступная для понимания информация в рамках профессиональных компетенций специалистов  

об актуальном уровне развития ребенка и прогноз на определённый уровень образования.

 

ТПМПК – это команда специалистов, в своем заключении формулирующих:

— обоснованные выводы о наличии либо отсутствии у ребенка особенностей в физическом и (или) психическом развитии и (или) отклонений в поведении и наличии либо отсутствии необходимости создания условий для получения ребенком образования, коррекции нарушений развития и социальной адаптации на основе специальных педагогических подходов;

— рекомендации по определению формы получения образования, образовательной программы, которую ребенок может освоить, форм и методов психолого-медико-педагогической помощи, созданию специальных условий для получения образования.

 

Обследование детей проводится каждым специалистом комиссии индивидуально или несколькими специалистами одновременно. Состав специалистов комиссии, участвующих в проведении обследования, процедура и продолжительность обследования определяются исходя из задач обследования, а также возрастных, психофизических и иных индивидуальных особенностей детей.

 

Обследование детей проводится в помещениях, где размещается комиссия. При необходимости и наличии соответствующих условий обследование детей может быть проведено по месту их проживания и (или) обучения.

 

Обследование детей, консультирование детей и их родителей (законных представителей) специалистами комиссии осуществляется бесплатно.

 

Заключение комиссии носит для родителей (законных представителей) детей рекомендательный характер.

 

Информация, полученная в ходе работы с ребенком и его семьей является конфедициальной и не может использоваться во вред правам и законным интересам ребенка.

 

Ребенок до 18 лет приходит на комиссию в сопровождении родителя, (законного представителя).

 

К нам могут обратиться: 

  • родители с детьми в возрасте от рождения до 18 лет
  • работники образовательных организаций, организаций, осуществляющих социальное обслуживание, медицинских организаций, других организаций

 Прием осуществляют специалисты:

  • педагог-психолог: Свинцова Анастасия Игоревна
  • учитель-логопед: Киселева Татьяна Юрьевна
  • учитель дефектолог: Шахматова Антонина Ивановна
  • социальный педагог: Кочнова Надежда Ивановна
  • врач- невролог: Тарасюк Татьяна Александровна
  • врач-психиатр: Капитонова Татьяна Дмитриевна
  • секретарь: Иванова Любовь Михайловна

 

Если у вас Вас есть вопросы, задавайте их:

По телефону: 8 (39143) 2-21-52

По электронной почте: [email protected]

Приходите по адресу:

663491, Кежемский район, г. Кодинск, ул. Колесниченко, д. 10

Телефон доверия

             

ТМПК — Фосфотрансферазы — Трансферазы — Ферменты

Тимидилаткиназа (она же TMPK; EC 2.7.4.9) участвует в пути биосинтеза dTTP, который является частью метаболизма пиримидина. Он фосфорилирует тимидин-5′-монофосфат (dTMP) до тимидин-5′-дифосфата (dTDP) и, наконец, с помощью нуклеозид-дифосфаткиназы (NDK; EC 2.7.4.6) до тимидинтрифосфата (dTTP), строительного блока ДНК. Этот путь уникален тем, что все другие dNDP, включая dUDP, непосредственно продуцируются рибонуклеотидредуктазой (RNR; EC 1.17.4.1). TMPK играет важную роль в пролиферации клеток и хорошо известна как потенциальная мишень для лекарств, причем наиболее заметная функция заключается в активации пролекарств нуклеозидов против ВИЧ. Недавние исследования показали, что ТМПК является проверенной мишенью для разработки антибиотиков против грамположительных бактерий M.tuberculosis и S.aureus [1], а также модулятором, который может повышать потенциал противоопухолевого агента доксорубицина в отношении раковых клеток толстой кишки независимо от статуса p53. [2]. Механистические исследования показали, что отсутствие функциональности TMPK в раковых клетках приводит к неправильному включению dUTP в репарацию ДНК, что приводит к гибели раковых клеток [3].


[1] Л. Сонг и др. Разработка запатентованного мотива ингибитора тимидилаткиназы в отношении противотуберкулезных агентов. Биоорг Мед Хим. 2016 1 ноября; 24 (21): 5172-5182.
[2] Q Cui et al. Тимидилаткиназа: старая тема открывает новые перспективы. Курр Мед Хим. 2013;20(10):1286-305.
[3] CM Hu et al. Опухолевым клеткам требуется тимидилаткиназа, чтобы предотвратить включение dUTP во время репарации ДНК. Раковая клетка. 2012 10 июля; 22(1):36-50.

ID аксона Имя Описание От цены
2675 YMU1 Селективный ингибитор тимидилаткиназы человека (hTMPK) €110.00

ТМПК — Креативные ферменты

TMPK (EC 2.7.4.9, тимидинмонофосфаткиназа) относится к классу трансфераз, является трансферазой фосфатной группы. Систематическое название этого фермента — АТФ:dTMP фосфотрансфераза. Другие широко используемые названия включают тимидинмонофосфаткиназу, тимидилаткиназу, тимидилатмонофосфаткиназу, киназу тимидиловой кислоты, тимидилкиназу, дезокситимидин-5′-монофосфаткиназу, TMPK и тимидин-5′-монофосфаткиназу.TMPK катализирует фосфорилирование тимидин-5′-монофосфата (dTMP) с образованием тимидин-5′-дифосфата (dTDP) в присутствии АТФ и Mg 2+ . dTDP дополнительно фосфорилируется нуклеозид-дифосфаткиназой (NDK) с образованием тимидин-5′-трифосфата (dTTP). В качестве субстрата для TMPK dTMP поступает либо из пути спасения, либо из пути de novo , поэтому TMPK действует на стыке путей de novo и спасения синтеза dTTP.

Структура

TMPK принадлежит к семейству киназ NMP, которое имеет высококонсервативную укладку, но имеет меньше консервативных последовательностей.Все ТМПК являются гомодимерами, каждая субъединица состоит из 7-11 α-спиралей, окружающих 5 центральных параллельных β-цепей. TMPK содержит три домена: домен лиганд-индуцированной деградации (LID), сайт связывания NMP и домен CORE. Домен LID является гибким, частично окружающим донор фосфата, что позволяет осуществлять перенос фосфатных групп. Домен CORE содержит фосфатсвязывающую петлю (P-петлю) и сайт связывания АТФ. Р-петля включает структурные элементы, необходимые для распознавания субстрата и катализа, а Р-петля связывается и локализуется с α- и β-фосфорильными группами АТФ.Все известные TMPK имеют аналогичный домен CORE.

Рисунок 1. Структура ТМПК. (Цуй К., 2013 г.)

ТМПК подразделяются на два типа в зависимости от положения основного остатка в его активном центре. Тип I TMPK в основном происходит от эукариот, и они имеют основные остатки в дополнение к инвариантному лизину в P-петле. TMPK типа II в основном происходит от прокариот, у которых отсутствуют основные остатки в P-петле, но есть основные остатки с аналогичными эффектами в домене LID.Не стоит также отмечать, что ТМПК M.tuberculosis не относится ни к типу I, ни к типу II, и ее каталитический механизм также различен.

Каталитический механизм

TMPK представляет собой нуклеозидмонофосфаткиназу, которая катализирует превращение dTMP в dTDP в присутствии АТФ и Mg 2+ : АТФ + тимидин-5′-фосфат ⇌ АДФ + тимидин-5′-дифосфат. В качестве субстрата для TMPK, dTMP в основном происходит из путей спасения и путей синтеза de novo, поэтому TMPK функционально локализован на стыке путей спасения и путей синтеза de novo.Тимидиновое основание dTMP связывается между Phe72 и поверхностью, образованной спиралью 5 P-петли. Исследования семейства NMP показали, что субстраты индуцируют изменения конформации сайта связывания NMP, и было обнаружено несколько конформационных состояний TMPK, связанных с каталитическим механизмом фермента. В отсутствие лиганда ТМПК находится в открытом состоянии, в котором домен LID неупорядочен. В присутствии dTMP TMPK частично закрывается, а домен LID в большинстве структур разупорядочен.В случае, когда оба субстрата сосуществуют, TMPK находится в полностью закрытом состоянии, и домен LID упорядочен. Во время каталитического процесса движение P-петли вызывает изменение конформации из открытого состояния в закрытое, приближая нуклеозидтрифосфатный фрагмент к акцептору фосфорила.

Рисунок 2. Функциональный путь тимидилаткиназы. (Лави А. 2004 г.)

Рисунок 3. Механизм связывания dTMP с TMPK. (Лави А. 2004 г.)

Заявка

Являясь ключевым ферментом в синтезе dTTP, TMPK может быть потенциальной мишенью для лекарств при различных заболеваниях, особенно при инфекционных заболеваниях.Прерывание метаболизма dTTP может быть использовано для предотвращения развития таких заболеваний. Когда пациент принимал анти-ВИЧ нуклеозидный аналог AZT, он сначала фосфорилировался тимидинкиназой до 3′-азидо-3′-дезокситимидинмонофосфата (AZTMP). AZTMP далее фосфорилируется TMPK в 3′-азидо-3′-дезокситимидиндифосфат (AZTDP). AZTMP является плохим субстратом для TMPK человека (hTMPK), поэтому превращение в AZTDP является этапом, ограничивающим скорость в процессе активации. Заключительный этап активации осуществляется основной неспецифической нуклеозиддифосфаткиназой (NDK) с образованием 3′-азидо-3′-дезокситимидинтрифосфата (AZTTP).AZTTP имеет 3′-азидогруппу, заменяющую 3′-ОН рибозы, которая останавливает синтез ДНК или действует как ингибитор ДНК-полимеразы, блокируя синтез ДНК. hTMPK является важным ферментом, контролирующим скорость процесса на протяжении всего процесса активации.

Ингибирование ТМПК является эффективной стратегией для открытия лекарств от инфекционных заболеваний, таких как бактериальные и паразитарные инфекции. Тонкие различия в активных сайтах hTMPK и TMPK патогенов дают возможность разработать селективные ингибиторы.Кроме того, ингибиторы hTMPK можно использовать в сочетании с противораковыми средствами для лечения некоторых сложных онкологических заболеваний.

Ссылки

  1. Cui, Q., Shin, WS, Luo, Y., Tian, ​​J., Cui, H., Yin, D. Тимидилаткиназа: старая тема открывает новые перспективы. Curr Med Chem , 2013, 20(10):1286-305.
  2. Лави А., Конрад М. Структурные требования для эффективного фосфорилирования аналогов нуклеотидов тимидилаткиназой человека. Mini Rev Med Chem , 2004, 4(4):351-9.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только та информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Трансгенная направленная на сердце гиперэкспрессия тимидилаткиназы человека

Генерация управляемого промотором тяжелой цепи альфа-миозина мышей hTMPK TG

Установленные методы 16 использовали, как описано ранее. 17 Они применялись к конструкции кДНК hTMPK. 18 Ген TMPK включает мутацию R200A. Эта мутация изначально была сделана для облегчения структурных исследований TMPK, и она не влияет на кинетическое поведение фермента. 19 Были созданы три трансгенные линии (A, B, C) для направленной сверхэкспрессии hTMPK.FVB/n (завод JAX, лаборатория Джексона, Бар-Харбор, Мэн, США) был инбредным фоном. Животных разводили в течение пяти поколений (для обеспечения трансгенеза зародышевой линии) перед началом экспериментальных исследований. У однопометников TG или WT не было выявлено никакого грубого фенотипа. Никаких изменений в поведении, росте, созревании, поведении при размножении или менделевском распределении TG не произошло.

Анализ копий гена TG

Для определения относительного количества копий в каждой линии был полуколичественно проанализирован уровень hTMPK в экстрактах ДНК хвоста мыши с использованием ПЦР в реальном времени и набора Light Cycler TaqMan Master.Гены-мишени амплифицировали с использованием специфических праймеров для hTMPK (прямой TMPK/LC: 5′-ATGAGAACGGGGCTTTCC-3′, обратный TMPK/LCR: 5′-TTTGGAAGCATCCACCATCT-3′ и зонд №31 из библиотеки Universal Probe Library; Roche Diagnostics Corp., Индианаполис). , Индиана, США) и ген «домашнего хозяйства», GAPDH (прямой: 5′-GATGCTACAAGCAGGCCTTT-3′, обратный: 5′-GCAGAAAGCAAGGGCAAA-3′ и зонд Universal ProbeLibrary № 4; Roche Diagnostics Corp.). Амплификацию ДНК проводили с использованием LightCycler 480 (Roche Diagnostics Corp.) на отдельных тканях, выделенных не менее чем от пяти-семи мышей в каждой линии.Дозу относительного количества копий нормализовали по отношению к эндогенной мышиной TMPK (ген с единственной копией) от дикого типа.

Дальнейшая проверка/отбор hTMPK осуществлялась с помощью ПЦР-амплификации хвостовой ДНК с использованием двух специфических праймеров, которые идентифицируют часть промотора α -MHC в тандеме с геном hTMPK, тем самым избегая амплификации эндогенной мышиной TMPK (TMPK вперед). 5′-CACATAGAAGCCTAGCCCACA-3′ и TMPK превращают 5′-TATAGTCGACTCACTTCCATAGCTCCCACAGCGG-3′).

Протоколы антиретровирусного лечения

Все процедуры проводились в соответствии с рекомендациями Комитета Эмори по уходу и использованию животных в учреждениях и рекомендациями NIH.Однопометники WT и TG (оба пола) были одного возраста (8–12 недель) в начале лечения. Еда и вода были предоставлены ad libitum в условиях 12-часового освещения/темноты, влажности и температуры в Эмори. Антиретровирусные препараты были от производителей (с уважением Центр фармакологии исследований СПИДа Эмори). Дозирование осуществляли через зонд (утром). Схемы лечения были аналогичны схемам лечения людей и включали AZT (0,22 мг/день; 0,25 мл в 1% CMC), RCV (1.025 мг/день в физиологическом растворе) или только соответствующие носители. На 35-й день проводили взвешивание животных и эхокардиографические измерения 20 и животных умерщвляли. Эта дата окончания была выбрана экспериментально на основании наших предыдущих данных, которые показывают, что в течение 35 дней после лечения AZT происходят измеримые изменения сердечной функции. 9, 10, 21, 22, 23 Образцы сердца были быстро извлечены и заморожены (хранение при температуре -80°C) для последующего выделения и анализа ДНК или были зафиксированы для гистологии (10% нейтральный забуференный формалин; Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания). , США) и электронной микроскопии (ЭМ).

Эхокардиография мышей TG

Массу ЛЖ и конечно-диастолический размер ЛЖ (LVEDD) определяли, как описано ранее, с использованием эхокардиографии (ECHO) у однопометных мышей WT и TG соответствующего возраста и пола. 23 Вкратце, массу ЛЖ рассчитывали на основании измерений толщины стенки ЛЖ и размеров по установленной формуле.

Количественное определение мтДНК и яДНК в ткани сердца с использованием ПЦР в реальном времени

Используемые методы были основаны на модификациях методов, используемых другими 24 , и подробно описаны нами. 9, 25 Амплификацию проводили на LightCycler 480 (Roche Diagnostics). Кривые эффективности, соответствующие митохондриальной и яДНК, использовали для определения отношения мтДНК к яДНК в каждом образце. Для содержания мтДНК результирующие значения выражали как среднее ± стандартная ошибка (sem), нормализованные к среднему значению WT, обработанному носителем (установленному на 1,0). Значение P <0,05 считалось статистически значимым.

Оценка патологических изменений тонкой структуры митохондрий с помощью трансмиссионной ЭМ повреждения митохондрий в hTMPK TG

Ультраструктуру митохондрий оценивали с использованием трансмиссионной ЭМ для подтверждения данных ЭХО и распространенности мтДНК с использованием методов, которые напоминают те, которые регулярно используются в лаборатории. 26 Каждая ЭМ фотография была рассмотрена независимо двумя исследователями на предмет наличия структурно аномальных митохондрий, повышенного количества митохондриальных профилей на поле, внутримитохондриальных ламеллярных тел, аномальной плотности крист, редупликации крист, набухания митохондрий и внутримитохондриальных паракристаллов, как это было сделано другими исследователями. 27

Гистологический анализ

Образцы сердца были обработаны, сделаны срезы (6  мкм мкм), окрашены гематоксилином и эозином (H&E) и исследованы под микроскопом, как это было сделано нами ранее. 28 Изображения были сохранены в электронном виде для сравнения гистопатологических признаков.

Экспериментальный анализ и статистика

Значения массы ЛЖ, LVVEDD и мтДНК сравнивали в когортах WT, TGs и NA с использованием ANOVA в GraphPad Prism 4 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния, США). Апостериорное тестирование использовало тест Ньюмена-Кеула и непарный t -тест. Статистически значимым считалось значение P <0,05 (определяемое с помощью непарного теста Стьюдента t ).

Дифференциальная экспрессия ферментов биосинтеза тимидилата у рыбок данио на разных стадиях развития: значение для нейродегенеративных заболеваний, вызванных мутацией dtymk | BMC Neuroscience

  • Howe K, Clark MD, Torroja CF, Torrance J, Berthelot C, Muffato M, Collins JE, Humphray S, McLaren K, Mattews L, et al. Последовательность эталонного генома рыбок данио и его связь с геномом человека. Природа. 2013; 496:498–503.

    КАС Статья Google ученый

  • Голлинг Г., Амстердам А., Сан З., Антонелли М., Мальдонадо Э., Чен В., Берджесс С., Халди М., Артцт Л., Фаррингтон С. и др.Инсерционный мутагенез у рыбок данио быстро идентифицирует гены, необходимые для раннего развития позвоночных. Нат Жене. 2002; 31: 135–40.

    КАС Статья Google ученый

  • Санторо ММ. Рыбки данио как модель для изучения клеточного метаболизма. Тенденции Эндокринол Метаб. 2014; 25: 546–54.

    КАС Статья Google ученый

  • Кари Г., Родек У., Диккер А. Рыбки данио: новая модельная система для изучения болезней человека и открытия лекарств.Клин Фармакол Тер. 2007; 82: 70–80.

    КАС Статья Google ученый

  • Arnér ESJ, Eriksson S. Дезоксирибонуклеозидкиназы млекопитающих. Фармак Тер. 1995;67(2):155–86.

    Артикул Google ученый

  • Wang L, Eriksson S. Тканеспецифическое распределение ферментов спасения пиримидиндезоксинуклеозидов проливает свет на механизм истощения митохондриальной ДНК.Нуклеозиды Нуклеотиды Нуклеиновые кислоты. 2010;29:400–3.

    КАС Статья Google ученый

  • Wang L, Sun R, Eriksson S. Базовая биохимическая характеристика цитозольных ферментов в синтезе тимидиновых нуклеотидов в тканях взрослых крыс: последствия для тканеспецифического истощения митохондриальной ДНК и терапия на основе дезоксинуклеозидов для дефицита TK2. BMC Mol Cell Biol. 2020;21:33.

    Артикул Google ученый

  • Леффлер М., Керри Э.А., Замейтат Э.Новые взгляды на роль пиримидинов в центральной нервной системе. Нуклеозиды Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты. 2018; 37: 290–306.

    Артикул Google ученый

  • Саада А., Шааг А., Мандель Х., Нево Ю., Эрикссон С., Эльпелег О. Мутантная митохондриальная тимидинкиназа при миопатии с истощением митохондриальной ДНК. Нат Жене. 2001; 29: 342–4.

    КАС Статья Google ученый

  • Лам К.В., Юнг В.Л., Линг Т.К., Вонг К.С., Лоу К.И.Дезокситимдилаткиназа, DTYMK , представляет собой новый ген синдрома истощения митохондриальной ДНК. Клин Чим Акта. 2019; 496: 93–9.

    КАС Статья Google ученый

  • Vanoevelen JM, Bierau J, Grashorn J, Lambrichs E, Kamsteeg E-J, Bok L, Wevers R, Van der Knaap M, Bugiani M, Hu Frisk JM, et al. DTYMK необходим для целостности генома и выживания нейронов. Акта Нейропатол. 2022; 143: 245–62.

    Артикул Google ученый

  • Амстердам А., Ниссен Р.М., Сан З., Суинделл Е.К., Фаррингтон С., Хопкинс Н.Идентификация 315 генов, необходимых для раннего развития рыбок данио. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101:12792–7.

    КАС Статья Google ученый

  • Виллер Г.Б., Ли В.М., Грегг Р.Г., Линк Б.А. Анализ мутации perplexed у рыбок данио выявил тканеспецифические роли de novo синтеза пиримидина во время развития. Генетика. 2005; 170:1827–37.

    КАС Статья Google ученый

  • Ng A, Uribe RA, Yieh L, Nuckels R, Gross JM.Мутации рыбок данио в gart и paics идентифицируют решающую роль синтеза пурина de novo в пигментации позвоночных и развитии глаз. Разработка. 2009; 136:2601–11.

    КАС Статья Google ученый

  • Ng BG, Wolfe LA, Ichikawa M, Markello T, He M, Tifft CJ, Gahl WA, Freeze HH. Биаллельные мутации при ИБС нарушают биосинтез de novo пиримидинов и уменьшают количество предшественников гликозилирования.Хум Мол Жене. 2015;24:3050–7.

    КАС Статья Google ученый

  • Кейн Д.А. Клеточный цикл и развитие у эмбрионов рыбок данио. В кн.: Методы клеточной биологии. Том 59 . Под редакцией Х. Уильяма Детрича III MW, Леонарда И. Зона: Academic Press; 1999: 11–26.

  • Сонг Ю., Мармион Р.А., Пак Д.О., Бисвас Д., Рабинович Д.Д., Шварцман С.Ю. Динамический контроль синтеза dNTP у ранних эмбрионов. Ячейка Дев.2017;42:301–8.

    КАС Статья Google ученый

  • Чен Ю.Л., Эрикссон С., Чанг З.Ф. Регуляция и функциональный вклад тимидинкиназы 1 в восстановление повреждений ДНК. Дж. Биол. Хим. 2010; 285:27327–35.

    КАС Статья Google ученый

  • Huang SH, Tang A, Drisco B, Zhang SQ, Seeger R, Li C, Jong A. Киназа dTMP человека: экспрессия генов и ферментативная активность, совпадающие с развитием клеточного цикла и ростом клеток.ДНК-клеточная биол. 1994; 13: 461–71.

    КАС Статья Google ученый

  • Gasparri F, Wang N, Skog S, Galvani A, Eriksson S. Экспрессия тимидинкиназы 1 определяет активированное состояние G1 клеточного цикла, которое выявляется с помощью сайт-специфических антител и анализов ArrayScan. Eur J Cell Biol. 2009; 88: 779–85.

    КАС Статья Google ученый

  • Аранда-Анзальдо А., Дент М.А.Почему нейроны коры не могут делиться и почему они обычно погибают при попытке? J Neurosci Res. 2017;95:921–9.

    КАС Статья Google ученый

  • Уайт Р.Дж., Коллинз Дж.Э., Сили И.М., Вали Н., Д’ули К.М., Дигби З., Стемпл Д.Л., Мерфи Д.Н., Биллис К., Хурлиер Т. и др. График экспрессии мРНК с высоким разрешением во время эмбрионального развития у рыбок данио. электронная жизнь. 2017;6:e30860.

    Артикул Google ученый

  • Лю Б., Гробханс Дж.Роль метаболизма dNTP в контроле эмбрионального клеточного цикла. Клеточный цикл. 2019;18:2817–27.

    КАС Статья Google ученый

  • Van Rompay A, Johansson M, Karlsson A. Фосфорилирование нуклеозидов и аналогов нуклеозидов нуклеозидмонофосфаткиназами млекопитающих. Фармакол Тер. 2000; 87: 189–98.

    Артикул Google ученый

  • Тамия Н., Юса Т., Ямагучи Ю., Цукифудзи Р., Куроива Н., Морияма Ю., Фуджимура С.Совместная очистка тимидилаткиназы и цитозольной тимидинкиназы из доношенной плаценты человека с помощью аффинной хроматографии. Биохим Биофиз Акта. 1989; 16: 28–35.

    Артикул Google ученый

  • Shiosaka T, Arima T, Toide H, Okuda H, Fuji S. Внутриклеточное распределение различных ферментов, связанных с синтезом ДНК, из нормальной и регенерирующей печени крыс и саркомы йошида. Дж Биохим. 1975; 77: 249–56.

    КАС пабмед Google ученый

  • Исогай С., Хоригучи М., Вайнштейн Б.М.Сосудистая анатомия развивающихся рыбок данио: атлас эмбрионального и раннего личиночного развития. Дев биол. 2001; 230: 278–301.

    КАС Статья Google ученый

  • Ostermann N, Brundiers SR, Konrad M, Reinstein J, Veit T, Goody RS, Lavie A. Представление о механизме фосфорилтрансфера тимидилаткиназы человека, полученное из кристаллических структур ферментных комплексов вдоль координаты реакции. Структура. 2000; 8: 629–42.

    КАС Статья Google ученый

  • Hu Frisk JM, Vanoevelen JM, Bierau J, Pejler G, Eriksson S, Wang L. Мутации DTYMK , выявленные у пациентов с тяжелой микроцефалией: замены одиночных аминокислот нарушают димеризацию и отменяют ее каталитическую активность. АСУ Омега. 2021; 6: 33943–52.

    Артикул Google ученый

  • Ху Фриск Дж.М., Эрикссон С., Пейлер Г., Ван Л.Идентификация новой активности тимидилаткиназы. Нуклеозиды Нуклеотиды и нуклеиновые кислоты. 2020; 39: 1359–68.

    Артикул Google ученый

  • Blader P, Strähle U. Генетика развития рыбок данио и развитие центральной нервной системы. Хум Мол Жене. 2000; 9: 945–51.

    КАС Статья Google ученый

  • Киммел С.Б., Варга Р.М., Кейн Д.А. Клеточные циклы и клональные цепочки при формировании центральной нервной системы рыбок данио.Разработка. 1994; 120: 265–76.

    КАС Статья Google ученый

  • Киммел С.Б., Баллард В.В., Киммел С.Р., Ульман Б., Шиллинг Т.Ф. Стадии эмбрионального развития рыбок данио. Дев Дин. 1995; 203: 253–310.

    КАС Статья Google ученый

  • Du C, Niu R, Chu E, Zhang P, Lin X. Анализ последовательности и функциональное исследование тимидилатсинтазы рыбок данио, Danio rerio .Дж Биохим. 2006; 139: 913–20.

    КАС Статья Google ученый

  • Туссен М., Дионн И., Веллингер Р.Дж. Ограниченное поступление ТТФ влияет на регуляцию длины теломер независимым от теломеразы образом. Нуклеиновые Кислоты Res. 2005; 33: 704–13.

    КАС Статья Google ученый

  • Du Sert NP, Hurst V, Ahluwalia G, Alam S, Avey MC, Baker M, Browne WJ, Clark A, Cuthill IC, Dirnagl U, et al.Руководство ARRIVE 2.0: Обновленное руководство по отчетности об исследованиях на животных. Бр Дж. Фармакол. 2020;177:3617–24.

    Артикул Google ученый

  • Palacino JJ, Sagi D, Goldberg MS, Krauss S, Motz C, Wacker M, Klose J, Shen J. Митохондриальная дисфункция и окислительное повреждение у мышей с дефицитом паркина. Дж. Биол. Хим. 2004;279(18):18614–22.

    КАС Статья Google ученый

  • Карнрот К., Вехели Р., Эрикссон С., Бёльске Г., Ван Л.Молекулярная характеристика тимидинкиназы из Ureaplasma urealyticum : аналоги нуклеозидов как мощные ингибиторы роста Mycoplasma . Мол микробиол. 2003; 50: 771–80.

    КАС Статья Google ученый

  • Nikkannen J, Forsström S, Euro L, Paetau I, Kohnz RA, Wang L, Chilov D, Viinamäki J, Roivainen A, Marjamäki P, et al. Дефекты репликации митохондриальной ДНК нарушают клеточные пулы dNTP и реконструируют одноуглеродный метаболизм.Клеточный метаб. 2016; 23:1–14.

    Артикул Google ученый

  • Kumar JK, Holmgren S, Levedahl KH, Höglund M, Venge P, Eriksson S. AroCell TK 210 ELISA для определения белка TK1: референсные диапазоны, связанные с возрастом, и сравнение с другими анализами TK1. Биотехнологии. 2020; 68: 334–41.

    КАС Статья Google ученый

  • SJVFS. Statens jordbruksverks författningssamling.Сакнр Л. 2019; 150:9 ISSN 1102 – 0970.

    Google ученый

  • Новая многообещающая цель для разработки противогрибковых препаратов — биологические науки

    21 сентября 2017 г.

    Тимидилаткиназы (ТМПК) несут исключительную ответственность за превращение dTMP в dTDP, важный промежуточный продукт для репликации и восстановления ДНК.Таким образом, ТМПК являются привлекательной лекарственной мишенью, и были разработаны ингибиторы против ТМПК человека (для лечения рака), M. tuberculosis (лечение туберкулеза) и P. falciparum (лечение малярии). Кроме того, TMPK человека участвует в активации пролекарства против ВИЧ AZT, превращая монофосфатную форму (AZTMP) в дифосфатную (AZTDP).

    В недавней работе, опубликованной в журнале «Биохимия» научным сотрудником Каустубхом Синхой и профессором биологических наук Гордоном Рулом, исследуются структура и кинетические характеристики ТМПК многих различных организмов.Большой интерес для лаборатории Rule представляет TMPK грибкового патогена Candida albicans . Этот патоген может образовывать биопленки и является причиной большинства грибковых инфекций, связанных с медицинскими имплантатами и катетерными линиями. Исследования, посвященные ингибиторам ТМПК с противогрибковыми свойствами, до сих пор не проводились.

    Уникальной особенностью CaTMPK является наличие петли из 15 остатков (Ca-петля) между двумя спиралями фермента. Структура, полученная с помощью рентгеновских лучей, показывает, что эта петля хорошо структурирована, и после проведения нескольких биохимических экспериментов лаборатория Rule считает, что она регулирует ферментативную активность CaTMPK.Соответствующая петля намного короче в TMPK человека, и можно использовать это структурное различие для получения соединений, которые ингибируют только фермент из C. albicans , но не фермент человека.

    Лаборатория Rule также изучила ферментативную активность CaTMPK с различными субстратами, используя новый анализ активности на основе ЯМР. По сравнению с человеческим ферментом CaTMPK более активен в отношении dTMP и AZTMP. В отличие от человеческого фермента CaTMPK также проявляет активность с dGMP.

    Функциональные и структурные различия между CaTMPK и ферментом человека позволяют предположить, что тимидилаткиназа является многообещающей мишенью для разработки новых противогрибковых препаратов. Кроме того, уроки, извлеченные из фермента CaTMPK, могут быть применены для разработки мутантов TMPK человека, которые являются лучшими активаторами AZT, которые могут быть полезны в генной терапии.

    Синха К., Рул Г.С. Структура тимидилаткиназы из Candida albicans обнаруживает уникальный структурный элемент.Биохимия. 22 августа 2017 г.; 56 (33): 4360-4370. doi: 10.1021/acs.biochem.7b00498. Epub 2017 – 9 августа. PMID: 28742342

    Контроль размера пула dTTP с помощью комплекса/циклосомы, стимулирующего анафазу, необходим для поддержания генетической стабильности

    Аннотация

    Протеолиз, опосредованный комплексом/циклосомой (APC/C), стимулирует анафазу и необходим для сегрегации хромосом, выхода из митоза и Вход G1.Здесь мы показываем важность APC/C в контроле размера пула dTTP в клетках млекопитающих. Два фермента, тимидин киназа 1 (ТК1) и тимидилаткиназа (ТМПК), участвующие в образовании dTTP, являются мишенями пути APC/C. Мы демонстрируем что TMPK распознается и расщепляется APC/C-Cdc20/Cdh2-опосредованными путями от митоза до ранней фазы G1, тогда как TK1 предназначен для деградации с помощью APC/C-Cdh2 после выхода из митоза. Сверхэкспрессия TK1 и TMPK дикого типа вызывает пятикратное увеличение клеточного пула dTTP без стимулирования спонтанных мутаций в гене hprt ( гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы ).Напротив, коэкспрессия недеградируемых TK1 и TMPK увеличивает размер пула dTTP в 10 раз, что сопровождается резким Дисбаланс пула dNTP. Самое интересное, что нарушение протеолиза APC/C ТК1 и ТМПК приводит к задержке роста и резкое увеличение частоты генных мутаций. Мы пришли к выводу, что снижение размера пула dTTP посредством пути APC/C во время митоза и фаза G1 является важным средством для поддержания сбалансированного пула dNTP и предотвращения генетической нестабильности.

    Клеточное производство dTTP является строго регулируемым процессом, который координируется с репликацией ДНК в клеточном цикле (для обзор см. Reichard 1988). С использованием синхронизированных культур было показано, что размер пула dTTP в клетках S-фазы в 20 раз больше, чем в G0-фазе. клеток (Спироу и Райхард, 1988). Это колебание может быть связано с зависимой от клеточного цикла регуляцией ферментов, участвующих в образовании dTTP (Navalgund et al.1980 г.; Брэдшоу 1983; Шерли и Келли, 1988). Существует два основных пути, контролирующих синтез dTTP в клетках млекопитающих. В пути de novo тимидилатсинтетаза (TS) катализирует лимитирующую скорость стадию превращения dUMP в dTMP. Альтернативно, тимидинкиназа (ТК), ключевой фермент в путь спасения катализирует перенос концевого фосфата АТФ на 5′-гидроксильную группу тимидина с образованием dTMP. Последующий фосфорилирование dTMP тимидилаткиназой (TMPK) приводит к dTDP, который затем превращается в dTTP киназой dNDP (NDK) для синтеза ДНК (см. обзор Reichard 1988).Поскольку TMPK необходима для продукции dTTP как в пути спасения , так и в пути de novo, делеция гена TMPK является летальной для Saccharomyces cerevisiae (Sclafani and Fangman 1984; Su and Sclafani 1991). В настоящее время общепризнано, что специфичная для S-фазы активация транскрипции генов TS, цитозольных генов TK1, и TMPK является основным механизмом, ответственным за их повышающую регуляцию в S-фазе, таким образом стимулируя расширение пула dTTP для ДНК. синтез (Coppock and Pardee 1987; Sherley and Kelly 1988; Huang et al.1994 год; ДеГрегори и др. 1995 год; Лян и др. 1995).

    После завершения репликации ДНК синтез дТТФ больше не пользуется большим спросом во время фазы G2/M, а клеточный дТТФ падает до низкого уровня до середины фазы G1 следующего клеточного цикла. Однако, поскольку белки ТК1 и ТС все еще остаются интактными во время фазы G2/M интересно узнать, как пул dTTP подавляется в этот период. В связи с этим наша лаборатория ранее показала, что TK1 человека (hTK1) фосфорилируется по Ser13 в митотической фазе (Chang et al.1998), что, нарушая его активный статус тетрамеризации, снижает его каталитическую эффективность (Li et al. 2004). После выхода из митоза hTK1 распознается анафазно-промотирующим комплексом/циклосомой (APC/C)-Cdh2 через свой KEN-бокс, что приводит к APC/C-зависимой деградации; Таким образом, функция hTK1 отменяется при вступлении в фазу G1 клеточного цикла (Ke and Chang 2004). По-видимому, посттрансляционный контроль посредством фосфорилирования и APC/C-опосредованного протеолиза участвует в подавляющей регуляции. поставок dTTP из пути утилизации во время митотической прогрессии.Однако важно ли подавление синтеза dTTP в митозе для контроля рост клеток остается открытым вопросом.

    Убиквитинлигаза APC/C опосредует деградацию белков клеточного цикла во время митоза и фазы G1. Общеизвестно, что Cdh2 и Cdc20 являются двумя разными активаторами, которые распознают субстраты для APC/C-опосредованного протеолиза (обзор см. Peters 2002). Cdc20 временно активируется в митозе для нацеливания на циклин B1 и секурин для APC/C-опосредованного протеолиза посредством прямого связывание с боксом разрушения (D-box, RXXL) этих белков-субстратов (Pfleger et al.2001), тогда как APC/C-Cdh2 активируется при выходе из митоза и распознает либо D-, либо KEN-box (KEN) (Pfleger and Kirschner 2000). На сегодняшний день Cdc6 человека, киназа Aurora-A, Cdc20, Cdc25A и Skp2 идентифицированы как субстраты APC/C-Cdh2 у млекопитающих. клеток (Петерсен и др., 2000; Донцелли и др., 2002; Литтлпейдж и Рудерман, 2002; Башир и др., 2004; Вей и др., 2004). Помимо этих регуляторов клеточного цикла, TK1 человека и RNR R2 мыши (mrR2) распознаются Cdh2 для APC/C-опосредованного протеолиз (Chabes et al.2003а; Ке и Чанг, 2004). Соответственно, мы предположили, что путь APC/C-Cdh2 может играть важную роль в отмене поступления dNTP при входе в G1. фазы путем одновременной деградации rR2 и TK1. Чтобы проверить эту гипотезу, здесь мы определили вклад APC/C-опосредованного путь в контроле размера внутриклеточного пула dTTP.

    В этом исследовании мы обнаружили, что в дополнение к TK1, APC/C также нацелен на деградацию TMPK, и продемонстрировали, что разрушение APC/C-зависимый протеолиз как TK1, так и TMPK приводил к значительному увеличению пула dTTP в клетках.Потому что дТТП может действовать как аллостерический активатор и ингибитор восстановления rGDP и rCDP рибонуклеотидредуктазой (RNR) соответственно. (Eriksson et al., 1979; Reichard et al., 2000), увеличение пула dTTP также должно влиять на клеточные уровни dGTP и dCTP. Поэтому мы спросили, зависит ли APC/C протеолиз как hTK1, так и hTMPK играет роль в регуляции сбалансированного снабжения четырьмя dNTP для репликации ДНК. Наш результаты показали, что экспрессия недеградируемых TK1 и TMPK приводит к снижению скорости пролиферации клеток и значительному увеличение частоты генных мутаций, выявляя связь между системой митотической регуляции и важными событиями, которые происходят в S-фазе.

    Результаты

    APC/C-опосредованные пути регулируют размер внутриклеточного пула dTTP

    Чтобы определить специфический вклад APC/C-опосредованного протеолиза в размер пула dTTP, мы уменьшили экспрессию Cdh2 и Cdc20 с помощью экспериментов с siRNA и анализировали внутриклеточные уровни dTTP. По сравнению с нетрансфицированными клетками также поскольку клетки, трансфицированные двумя неродственными миРНК, клетки HeLa, лишенные Cdh2, содержали примерно в четыре раза больше dTTP, сопровождается значительным увеличением белка hTK1, что указывает на то, что APC/C-Cdh2-опосредованная деградация hTK1 действительно контролирует внутриклеточный пул dTTP (рис.1А). Интересно, что подавление экспрессии Cdc20 путем трансфекции клеток siRNA Cdc20 также повышало концентрацию клеточного dTTP без изменения уровня белка hTK1. Одновременный нокдаун как Cdh2, так и Cdc20 экспрессия приводила к семикратному увеличению пула dTTP по сравнению с клетками, трансфицированными контрольной siRNA (фиг. 1А). Чтобы узнать, было ли наблюдаемое увеличение пула dTTP связано с изменениями в распределении популяции клеток в клеточном цикле мы измеряли состояние клеточного цикла с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией (FACS) (рис.1Б). Процент клеток в фазах G1, S и G2/M был одинаковым для клеток, трансфицированных миРНК в контроле и Cdc20, , что указывает на то, что увеличение dTTP в клетках, обедненных Cdc20, не связано с изменением состояния клеточного цикла. . Несмотря на то что клетки, трансфицированные siРНК Cdh2 и Cdh2/Cdc20 , имели более высокий процент клеток во фракции S-фазы, чем контрольные клетки, очень маловероятно, что эти скромные различия в распределении клеточного цикла может вызвать резкое увеличение уровней экспрессии TK1 и пула dTTP.Эти экспериментальные результаты не только предполагают, что APC/C-Cdh2 может контролировать размер пула dTTP за счет увеличения накопления hTK1, но также предполагают что APC/C-Cdc20-опосредованный путь контролирует другие регуляторы, участвующие в синтезе dTTP.

    TMPK человека является прямой мишенью комплекса APC/C-Cdc20 и APC/C-Cdh2

    Путем анализа аминокислотных последовательностей молекул, участвующих в синтезе dTTP, включая TMPK, NDK, TS и деаминазу dCMP, Было обнаружено, что TMPK содержит несколько предполагаемых сайтов узнавания APC/C.Две D-, одна KEN- и две D-подобные коробки в ТМПК все они высококонсервативны у человека, мыши и крысы (дополнительная рис. 2), что позволяет предположить, что TMPK является потенциальной мишенью для АПК/С. Чтобы проверить, является ли TMPK мишенью Cdc20 или Cdh2, мы проверили эффект сверхэкспрессии Cdc20 и Cdh2. на экспрессию меченной Flag TMPK человека (hTMPK) путем котрансфекции вектора экспрессии FLAG-hTMPK либо pHA-Cdc20, или pHA-Cdh2 в клетках HeLa.Сверхэкспрессия либо Cdc20, либо Cdh2 значительно подавляла экспрессию FLAG-hTMPK в Клетки HeLa чувствительны к ингибитору протеасом, LLnL (рис. 2А). Это предполагает, что либо Cdc20, либо Cdh2 могут действовать как фактор, ограничивающий скорость протеасомозависимой деградации hTMPK. Поскольку принудительная экспрессия Cdc20 и Cdh2 также усиливала убиквитинилирование hTMPK in vivo (дополнительная рис. 3), мы затем оценивали, опосредуют ли Cdc20 и Cdh2 непосредственно убиквитинилирование hTMPK, путем проведения анализов полиубиквитинилирования in vitro с системой восстановления, содержащей очищенные APC/C, E1 и E2 (Ubch20 человека).Как показано на рисунке 2B, GST-hTMPK полиубиквитинилировали в реакционной смеси очищенных E1, E2 и APC/C в присутствии либо Cdc20, либо Cdh2 (дорожки 3,5). Включение доминантно-негативного C114S мутанта Ubch20 предотвращало полиубиквитинилирование hTMPK в этой системе. (рис. 2В, дорожки 4,6), что свидетельствует о специфичности реакции убиквитинилирования. Подобно человеческому Ubch20, UbcX Xenopus также давал аналогичную картину убиквитинилированных лестниц, полученных из hTMPK (рис.2Б, полосы 7,8). В отличие от hTMPK, полиубиквитинилирование GST-hTK1 зависело от APC/C-Cdh2, но не от APC/C-Cdc20 (рис. 2B, дорожка 10 по сравнению с дорожкой 11). На основании этих данных мы пришли к выводу, что как APC/C-Cdc20, так и APC/C-Cdh2 способны непосредственно убиквитинилировать hTMPK и что hTK1 распознается только APC/C-Cdh2, но не APC/C-Cdc20.

    Рисунок 1.

    Истощение либо Cdc20, либо Cdh2 увеличивает размер внутриклеточного пула dTTP.( A ) Клетки HeLa трансфицировали siRNAs, соответствующими нерелевантным мРНК светлячка (C1 и C2) и Cdc20, Cdh2, или Cdh2 мРНК, как указано. (NT) отсутствие трансфекции миРНК; ( Cdc20 / Cdh2 siRNAs) комбинация трансфекции Cdc20 и Cdh2 siRNAs. Через сорок восемь часов после трансфекции клетки экстрагировали для определения размера пула dTTP и вестерн-анализа. блотинг со специфическими антителами.Каждая точка данных представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение. из трех отдельных экспериментов. ( B ) Профили клеточного цикла клеток, обработанных миРНК, как указано, анализировали с помощью проточной цитометрии, и результаты выражали как процент клеток в фазах G1, S и G2/M.

    hTMPK предшествует hTK1 для APC/C-опосредованной деградации во время митотической прогрессии

    Для анализа эндогенной экспрессии hTMPK мы создали специфическое антитело к hTMPK.С помощью этого антитела мы исследовали клетки циклические колебания уровней hTMPK в клетках HeLa S3, которые были синхронизированы при митозе нокодазолом и высвобождены в G1. Уровень hTMPK оставался очень низким при остановке митоза и ранних клетках G1 и не повышался до середины фазы G1 (рис. 3А). Напротив, экспрессия hTK1 достигала своего максимального пика на стадии остановки митоза, при этом экспрессия снижалась. резко в ранней фазе G1, демонстрируя, что деградация hTMPK происходит раньше, чем hTK1, во время прогрессирования клеточного цикла (Рис.3А). Характер экспрессии hCdh2 и других известных субстратов APC/C, зависящих от клеточного цикла, включая Cdc20, циклин A 1, циклин B1, hrR2 и секурин также исследовали в том же наборе образцов. В качестве прямого теста APC/C-опосредованной деградации hTMPK и hTK1, мы подготовили митотические экстракты и экстракты G1 для проведения анализов деградации in vitro. Мы обнаружили, что 35 меченный S-метионином hTMPK разрушался как в митотическом экстракте, так и в экстракте G1, тогда как 35 меченный S-метионином hTK1 разрушался только в экстракте G1 (рис.3Б). Разложение hTMPK in vitro в митотическом экстракте было специфичным для APC/C, поскольку оно ингибировалось добавлением GST-(1–90) циклин B1, который является специфическим конкурентным ингибитором APC, но не GST-циклин B1 (ΔN90), лишенный D-бокса (рис. 3C). В экстракте G1 GST-hTK1 дикого типа, но не hTK1 с ​​мутацией KEN-box, конкурирует за деградацию hTMPK, что указывает на потребность в APC/C-Cdh2 для деградации hTMPK в фазе G1 (рис. 3D). Поскольку APC/C-Cdc20 активен только в митотической фазе, а APC/C-Cdh2 не активируется до ранней фазы G1, результаты Из этих экспериментов по деградации in vitro можно предположить, что APC/C-Cdc20 и APC/C-Cdh2 нацелены на деградацию hTMPK в митотическом и фазы G1 соответственно.Чтобы подтвердить участие Cdc20 и Cdh2 в дестабилизации hTMPK in vivo, мы затем исследовали влияние нокдауна Cdc20, Cdh2 и Cdc20 / Cdh2 на стабильность hTMPK в клетках HeLa. С этой целью мы использовали 35 S-метионин для импульсной метки клеток, которые были трансфицированы контрольными, Cdc20, Cdh2 или Cdc20 / Cdh2 миРНК, с последующим отслеживанием в течение 12 часов. Лизаты клеток 35 , меченных S-метионином, подвергали иммунопреципитации антителом hTMPK.Результаты показали, что после 12-часового периода погони <10% предварительно меченого чТМПК оставалось в контрольных клетках, трансфицированных миРНК, в то время как >80% предварительно меченого чТМПК все еще присутствовало в клетках. клетки, трансфицированные siРНК Cdc20 или Cdh2 (фиг. 3E). Кодеплеция Cdc20 и Cdh2 не вызывала распада предварительно меченой TMPK в течение 12-часовой погони. Эти результаты свидетельствуют о том, что период полужизни hTMPK был значительно продлен за счет истощения либо Cdc20, либо Cdh2.В параллельном эксперименте с погоней за импульсами мы обнаружили, что истощение Cdh2, но не Cdc20, стабилизировало меченый импульсами hTK1, последовательно указывая на специфический вклад Cdh2 к дестабилизации hTK1 (рис. 3E). Таким образом, подавление экспрессии Cdc20, Cdh2 или Cdc20/Cdh2 делает hTMPK более стабильным, тем самым увеличивая его экспрессию. уровень. Собрав эти результаты вместе, мы пришли к выводу, что Cdc20 нацеливает hTMPK на деградацию в фазе G2/M, а Cdh2 поддерживает его разрушение и нацеливание TK1 на протеолиз в ранней фазе G1.

    Рисунок 2.

    hTMPK является новым субстратом APC/C-Cdc20 и APC/C-Cdh2. ( A ) Клетки HeLa трансфицировали pCMV2FLAG-hTMPK и pEGFP с различными количествами либо pHA-Cdc20, либо pHA-Cdh2, как указано. Пустой вектор добавляли к смеси для трансфекции, чтобы общее количество ДНК для каждой трансфекции было одинаковым.Клетки обрабатывали без (–) или (+) LLnL за 6 ч до сбора урожая. После трансфекции в течение 24 часов клетки экстрагировали. для вестерн-блоттинга. Экспрессия GFP указывала на эффективность трансфекции среди разных образцов. ( B ) Полиубиквитинилирование in vitro проводили с использованием GST-hTMPK или GST-hTK1 в качестве субстрата в реакционной смеси, содержащей E1, E2 (UbcX или UbCh20), APC/C, Cdc20 или Cdh2, как указано.CS представляет собой мутант C114S Ubc10. Образцы были разделяли с помощью SDS-PAGE (градиент 5–15%) и анализировали вестерн-блоттингом с использованием антитела против GST, как указано. звездочка указывает на димерные формы hTK1 и hTMPK.

    APC/C регулирует размер пула dTTP посредством деградации hTK1 и hTMPK

    Поскольку TMPK необходима для образования dTTP как по пути спасения , так и по путям de novo, более ранняя деградация TMPK, чем TK1, может предоставить средства для минимизации поступления dTTP в митотический процесс. фаза.Затем мы определили уровни dTTP в клетках HeLa, которые были заблокированы в митотической фазе обработкой нокодазолом и освобождаются от митотического блока. Уровень dTTP был самым низким в митотически блокированных клетках, в которых экспрессировался уровень TMPK. также был очень низким. После освобождения от обработки нокодазолом пул dTTP увеличивался по мере того, как клетки приближались к середине фазы G1 (рис. 4), когда экспрессия hTMPK увеличивалась, а уровни экспрессии hTK1 были все еще очень низкими. Таким образом, колебание ТМПК уровни экспрессии во время митотической прогрессии коррелируют с колебаниями пула dTTP.

    Мы также подавляли экспрессию TMPK с помощью siRNAs, чтобы определить, происходит ли резкое увеличение размера пула dTTP за счет истощения Cdc20/Cdh2. в клетках HeLa зависит от TMPK. Ясно, что удаление эндогенной экспрессии hTMPK отменяет опосредованное Cdc20 / Cdh2 siRNAs увеличение пула dTTP (рис. 5). Истощение hTK1 в клетках с нокдауном Cdc20/Cdh2 также снижало пул dTTP, хотя и в меньшей степени по сравнению с Истощение hTMPK.Этот результат также свидетельствует о том, что APC/C-Cdh2-опосредованная деградация TK1 способствует значительной доле стимулирующий эффект на пул dTTP за счет истощения Cdc20/Cdh2 в клетках HeLa. Вестерн-блот-анализ показал, что экспрессия уровни hTMPK и hTK1 были значительно повышены за счет истощения Cdc20 / Cdh2 и котрансфекции siRNAs hTMPK или hTK1 соответственно эффективно устраняли экспрессию каждого белка (фиг. 5).Эти результаты являются прямым доказательством того, что hTK1 и hTMPK ответственны за активацию пула dTTP, индуцированную Истощение Cdc20 и Cdh2 в клетках HeLa.

    Сигнальные мотивы для APC/C-опосредованной деградации hTMPK

    Затем мы определили сигнальный мотив, ответственный за нацеливание hTMPK на протеолиз. Каждый мотив, включая два D-бокса (RXXL), один KEN-бокс и два подобных D-боксу (RXXF) в hTMPK были мутированы, как схематически показано на фиг. 6А.Поскольку Cdh2 и Cdc20 являются фактором, ограничивающим скорость деградации hTMPK, мы затем исследовали уровни экспрессии каждого мутанта. белка в ответ на коэкспрессию Cdc20 и Cdh2. Оказалось, что мутация второго D-бокса (D2 mt) приводит к появлению hTMPK. устойчивы к Cdh2- или Cdc20-опосредованной дестабилизации (Fig. 6B). Кроме того, мутант, несущий мутации в KEN-боксе (KEN mt), терял Cdh2-реактивность, а также становился менее чувствительным. до Cdc20, в то время как мутации любого из мотивов, подобных D-box, не изменяли чувствительность hTMPK к Cdc20- или Cdh2-опосредованному дестабилизация.Мутация первого D-бокса (D1) не влияла на Cdc20- или Cdh2-опосредованную деградацию TMPK (фиг. 6B). Эти результаты позволяют предположить, что Cdc20, вероятно, нацеливает hTMPK на деградацию, распознавая D-бокс в сайте D2, тогда как Cdh2-опосредованный деградация hTMPK требует интактности мотивов как D2, так и KEN. В подтверждение этой точки зрения мы нашли доказательства того, что интактный D-бокс в сайте D2 был необходим для GST-hTMPK, связанного с His-Cdh2 или His-Cdc20, а KEN-бокс был дополнительно необходим для связывания с His-Cdh2 (дополнительный рис.4). На этом основании мы затем проверили, являются ли мутации в сайтах D2 или KEN влияют на APC/C-Cdh2- или APC/C-Cdc20-опосредованное полиубиквитинилирование белка GST-hTMPK с использованием очищенного убиквитинилирования in vitro система. Соответственно, полиубиквитинилированные конъюгаты с более высокой молекулярной массой наблюдались для белка GST-hTMPK дикого типа. когда в анализ был включен APC/C-Cdc20 или APC/C-Cdh2 (рис. 6D). Для мутантов D2 и D2/KEN полиубиквитинилированные конъюгаты не наблюдались.Для мутанта KEN лестницы полиубиквитинилирования можно увидеть в реакции, содержащей APC/C–Cdc20, но не APC/C–Cdh2. Похоже, что мутации KEN-box нарушили hTMPK. белок, который должен быть полиубиквитинилирован реакцией E3, опосредованной APC / C-Cdh2, без влияния на опосредованную Cdc20 реакцию. Учитывая тот факт, что мутация KEN нарушает функциональную активность hTMPK (данные не показаны), возможно, что мутация Сайт KEN мог привести к конформационному изменению hTMPK, что препятствует распознаванию D-бокса с помощью Cdh2.Тем не менее, эти результаты предполагают, что D-box (сайт D2) белка hTMPK является необходимым мотивом для узнавания APC/C-Cdc20 и APC/C-Cdh2.

    Рисунок 3.

    hTMPK разлагается в фазе M и ранней стадии G1. ( A ) Клетки HeLa S3 останавливали обработкой нокодазолом в течение 20 часов с последующим добавлением свежей среды для высвобождения клеток. после ареста G2/M.Экстракты, приготовленные из клеток HeLa, освобожденных от G2/M, останавливали в различные моменты времени, как указано, анализируют вестерн-блоттингом со специфическими антителами. (Asn) Асинхронное состояние. ( B ) S 35 -меченый метионином Myc-hTMPK инкубировали с экстрактами M- и G1-фаз, как описано в материалах и методах для различных раз, как указано. Очищенный неразлагаемый циклин B1 (ΔN90 циклин B1) и белки hTK1 добавляли в каждый экстракт, чтобы указать специфичность деградации в анализе.( C ) Очищенный меченный GST (1–90) циклин B1 и (ΔN90) циклин B1 каждый добавляли к экстракту M для анализа разложения in vitro. of S 35 -меченый метионином Myc-hTMPK. ( D ) Очищенный меченный GST hTK1 дикого типа и KEN mt hTK1 каждый добавляли к экстракту G1 для анализа разложения in vitro меченного метионином S 35 Myc-hTMPK. ( E ) Клетки HeLa трансфицировали контрольными миРНК Cdc20 и Cdh2, как указано. (Cdc20/Cdh2) Комбинация Cdc20 и Cdh2 трансфекция миРНК.Через 36 часов после трансфекции клетки метаболически метили 35 S-метионином (250 мкКи/мл) в течение 30 минут с последующим отслеживанием в течение 0 и 12 часов. Клеточные лизаты подвергали иммунопреципитации анти-hTK1. и антитела против hTMPK отдельно. Иммунокомплексы разделяли на 12% SDS-PAGE с последующим Вестерн-блоттингом и авторадиография. Нормальный IgG кролика (IgG) использовали в качестве отрицательного контроля для иммунопреципитации.

    Рис. 4.

    Колебание размера пула dTTP во время митотической прогрессии. Клетки HeLa S3 были арестованы нокодазолом, как описано в легенде. для рисунка 3А. В разные моменты времени после выхода из митотического блока клетки экстрагировали для определения размера пула dTTP, как описано в материалах и методах. Каждая точка данных представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение. из трех отдельных экспериментов. (Asn) Асинхронное состояние.

    Рис. 5.

    TMPK требуется для увеличения пула dTTP, индуцированного инактивацией APC/C. Клетки HeLa трансфицировали миРНК. как указано. Через сорок восемь часов после трансфекции клетки экстрагировали для определения размера пула dTTP и вестерн-блоттинга. анализ.

    Нарушение APC/C-зависимой деградации TK1 и TMPK вызывает резкий дисбаланс dNTP

    Чтобы лучше понять влияние специфического нарушения деградации hTK1 и hTMPK на размер пула dTTP в нормальной клеточной линии, Клетки NIH 3T3, стабильно экспрессирующие сходные уровни дикого типа, мутантов с потерей функции или устойчивых к APC/C мутантов hTK1 и hTMPK были индивидуально отобраны и объединены.Каждая из клеток, экспрессирующих hTK1 или hTMPK дикого типа, давала трехкратное увеличение пула dTTP. по сравнению с ложными клетками, тогда как экспрессия АТФ-связывающего дефектного мутанта hTMPK (D15R) или тимидинсвязывающего дефектного мутант hTK1 (RFN) не изменял уровень пула dTTP (фиг. 7А). Эти результаты показывают, что функциональная активность обоих ферментов является ограничивающим фактором для снабжения dTTP в клетках NIH 3T3. Экспрессия недеградируемого мутанта KEN hTK1 или мутанта D2 hTMPK приводила к увеличению пула dTTP на 30–40 % по сравнению с с их белками дикого типа (рис.7А). Это умеренное увеличение dTTP может быть связано с низкими уровнями эндогенного hTK1, ограничивающего поступление dTMP в клетки, несущие сверхэкспрессию. Мутант D2 hTMPK. В свою очередь, уровень эндогенной ТМПК также может ограничивать повышение пула дТТФ при НИЗ. Клетки 3T3 со сверхэкспрессией стабилизированного hTK1. Если да, то влияние нарушения деградации hTK1 и hTMPK на пул dTTP должно быть выше в клетках, сверхэкспрессирующих как hTK1, так и hTMPK.Действительно, в то время как клетки со сверхэкспрессией hTK1 и hTMPK дикого типа (WT/WT) продемонстрировал пятикратное увеличение пула dTTP, коэкспрессия неразлагаемых hTK1 и hTMPK (KEN/D2) привела к более чем 10-кратному увеличению в пуле dTTP (фиг. 7А). Учитывая, что клеточные линии WT/WT и KEN/D2 экспрессировали одинаковые стационарные уровни hTK1 и hTMPK, а ферментативное каталитическая эффективность hTK1 (KEN) и hTMPK (D2) аналогична их белкам дикого типа (данные не показаны), мы приписываем значительная разница в размере пула dTTP между этими двумя клеточными линиями по сравнению с APC / C-опосредованной способностью к деградации hTK1 и чТМПК.

    Рисунок 6.

    D-box-зависимое распознавание hTMPK с помощью Cdc20 и Cdh2. ( A ) Схематическое изображение мутантов, несущих мутацию в различных сигнальных мотивах потенциальной деструкции hTMPK, как указано. ( B ) Клеточные экстракты готовили из клеток LM-TK , трансфицированных диким типом (wt) или различными мутантами pCMV2FLAG-hTMPK, как указано с (+) или без (–) pHA-Cdh2 или pHA-Cdc20 с последующим анализом SDS-PAGE и вестерн-блоттингом, как описано в подписи к рисунку 2A.( C ) Реакции полиубиквитинилирования in vitro hTMPK дикого типа, D2 mt, KEN mt и D2/KEN mt hTMPK проводили, как описано в легенде к рисунку 2B. Звездочка указывает на димерные формы hTK1 и hTMPK.

    Поскольку клетки KEN/D2 и WT/WT экспрессировали одинаковые устойчивые уровни hTK1 и hTMPK, мы затем проверили, экспрессируется ли уровни этих двух белков в этих двух клеточных линиях различались в зависимости от роста, что приводило к различиям дТТФ накапливается в клетках.С этой целью мы исследовали выраженные уровни hTK1 и hTMPK, а также размер пула dTTP. в клетках WT/WT и KEN/D2 в условиях депривации сыворотки и стимуляции сывороткой. Для клеток WT/WT мы наблюдали подавление пула hTK1, hTMPK и dTTP после депривации сыворотки; после стимуляции сывороткой уровни экспрессии как hTK1, так и hTMPK восстанавливались, что сопровождалось четырех-пятикратным увеличением пула dTTP. Напротив, в клетках KEN/D2 уровни hTK1, hTMPK и пул dTTP оставались повышенными независимо от депривации сыворотки.Таким образом, увеличение накопления dTTP в клетках KEN/D2 коррелирует со стабилизированным характером hTK1 и hTMPK, присутствующих в клетках.

    Мы также измерили уровни трех других dNTP в клетках WT/WT и KEN/D2. В клетках WT/WT пул dGTP был в четыре раза выше. чем в макетных клетках, в то время как не было никаких существенных различий в пулах dATP и dCTP (рис. 7C). В клетках KEN/D2 размер пула dGTP был увеличен в 12 раз по сравнению с ложными клетками, в то время как dATP был немного увеличилось, а dCTP уменьшилось на 50% по сравнению с фиктивными клетками (фиг.7С). Таким образом, в клетках KEN/D2 индуцируется серьезный дисбаланс пулов dNTP. Если рассматривать отношение dGTP/dCTP как пул dNTP индекс дисбаланса, он составляет 3, 12 и 0,6 для клеток, экспрессирующих дикий тип, недеградируемую форму и ложные клетки, соответственно. (рис. 7D). Соответственно, степень индукции дисбаланса пула дНТФ пятикратна и 20-кратна в клетках, экспрессирующих клетки дикого типа и недеградируемые. hTK1 и hTMPK соответственно. Таким образом, четырехкратное увеличение дисбаланса пула dNTP было вызвано нарушением митотического деградация ТК1 и ТМПК.

    Аналогично этому результату, в клетках HeLa, лишенных Cdc20/Cdh2, пулы как dGTP, так и dTTP были резко увеличены, что сопровождалось значительным уменьшением пула dCTP по сравнению с клетками, трансфицированными контрольной siРНК (рис. 8). Ясно, что интерференция митотической деградации эндогенных hTK1 и hTMPK за счет истощения Cdc20/Cdh2 вызывала более выраженное влияние на дисбаланс пула dNTP, чем то, что мы наблюдали в клетках KEN/D2; пул dGTP был увеличен в 28 раз, в то время как пул dCTP уменьшилось в семь раз, что соответствует примерно 200-кратному индукции дисбаланса пула dNTP (рис.8). Таким образом, можно ожидать, что нарушение регуляции пути APC/C в линии раковых клеток человека, содержащей повышенные уровни hTK1 и hTMPK вызовет очень серьезную индукцию дисбаланса пула dNTP.

    Рисунок 7.

    Одновременное нарушение деградации hTK1 и hTMPK увеличивает размер пула dTTP. ( A ) Клетки стабильной линии NIH 3T3 получали, как описано в разделе «Материалы и методы».Клетки экстрагировали для определения размера пула dTTP. измерение и вестерн-блоттинг, как описано в подписи к рисунку 1. ( B ) клетки NIH 3T3, стабильно экспрессирующие дикий тип (WT/WT) и недеградируемые мутантные (KEN/D2) hTK1 и hTMPK, лишены сыворотки и стимулировали по показаниям. (Asn) Асинхронное состояние; (SD) депривация сыворотки через 24 ч; (SD → SS) стимуляция сыворотки в течение 24 ч после 24-часовая депривация сыворотки. Клетки собирали для Вестерн-блоттинга и определения размера пула dTTP, как описано в легенда к рисунку 5.( C ) Четыре размера пула dNTP были определены в экстрактах из различных клеток стабильной линии 3T3 (Mock, WT/WT и KEN/D2), как описано в материалах и методах. Каждая точка данных представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение. из трех отдельных экспериментов. ( D ) Отношение dGTP к dCTP в каждой клеточной линии рассчитывали путем деления размера пула dGTP на размер пула dCTP. Пул dNTP фолды индукции дисбаланса выражали нормализацией отношения dGTP/dCTP клеток WT/WT и KEN/D2 по сравнению с Mock клетки.

    Стабилизация hTK1 и hTMPK подавляет рост клеток и вызывает повышенную генетическую нестабильность

    Затем мы дополнительно сравнили скорость роста клеток WT/WT, KEN/D2 и имитационных клеток (рис. 9А). Клетки KEN/D2 демонстрировали гораздо более медленную скорость роста, чем ложные клетки и клетки WT/WT, тогда как клетки WT/WT демонстрировали более быстрый рост. показатель. Это указывает на то, что степень изменения пула dNTP, наблюдаемая в клетках WT/WT, действительно способствует росту клеток, а степень Дисбаланс пула dNTP в клетках KEN/D2 вызывает задержку роста.Учитывая, что дисбаланс пула dNTP считается мутагенным (для обзор см. Kunz 1988; Meuth 1989), мы дополнительно исследовали, может ли дисбаланс пула dNTP, вызванный нарушением регуляции hTK1 и hTMPK, способствовать генетической нестабильности. путем измерения частоты спонтанных мутаций гена hprt . Культивируемые клетки (3 × 10 5 ) инкубировали в среде, содержащей 6-тиогуанин (6-ТГ), при этом появление резистентных клонов представляет собой спонтанную мутации в локусе hprt .Параллельно клетки (1 × 10 3 ) инкубировали в среде в отсутствие 6-TG для измерения их эффективности образования колоний. В соответствии с наблюдением при измерении скорости роста клетки, экспрессирующие KEN/D2, демонстрировали самую низкую эффективность образования колоний (фиг. 9В). После селекции с 6-TG ложные клетки и клетки WT/WT не образовывали каких-либо резистентных колоний, что указывает на то, что степень dNTP изменений пула в клетках WT/WT недостаточно, чтобы вызвать генетическую нестабильность, о чем свидетельствует сохранение функции гена hprt .Напротив, два разных клона клеток KEN/D2, несмотря на низкую эффективность клонирования, дали >500 устойчивых колоний на чашку в тех же экспериментальных условиях (фиг. 9В). РНК получали из 50 индивидуальных устойчивых к 6-ТГ клонов и подвергали ОТ-ПЦР с праймерами для гена hprt с последующим анализом последовательности. Различные типы мутаций, включая транзицию, инсерцию, делецию и трансверсию. были обнаружены в кодирующих последовательностях hprt в этих клонах (дополнительная таблица 1).Очевидно, высокая частота генетических мутаций наблюдалась у клетки KEN/D2. Сходные результаты также наблюдались в экспериментах, когда клетки фибробласта легких китайского хомяка (CHL) V79 были используется для создания стабильных клеточных линий (дополнительная рис. 5). Поскольку разница в частоте мутаций была столь значительна между В клетках WT/WT и KEN/D2 это говорит о том, что не только APC/C-зависимая деградация TK1 и TMPK играет важную роль. уменьшая пул dTTP, он также предотвращает дисбаланс пула dNTP, ведущий к генетической нестабильности.

    Рисунок 8.

    Нокдаун Cdc20/Cdh2 в клетках HeLa вызывает дисбаланс пула dNTP. Клетки HeLa трансфицировали siРНК против Cdc20 и Cdh2 одновременно, как описано в подписи к рисунку 1. Клетки экстрагировали для четырех определений размера пула dNTP, как описано в разделе «Материалы и методы». Каждая точка данных представляет среднее значение ± S.D. из трех отдельных экспериментов. (Контроль) Контрольная трансфекция миРНК.

    Обсуждение

    Исследования важной роли APC/C-зависимого протеолиза в прогрессировании клеточного цикла были в основном сосредоточены на его функции. в разделении сестринских хроматид и выходе из митоза посредством деградации субстратов, таких как секурин и митотические циклины (для обзор см. Harper et al.2002). В этом исследовании наши результаты продемонстрировали еще одну важную роль APC/C: регуляция размера пула dTTP посредством деградации. ТК1 и ТМПК во время митотической прогрессии. Мы показали, что этот механизм контроля необходим для поддержания сбалансированного пул dNTP, в то время как его дерегуляция может привести к замедлению роста и заметному увеличению частоты генетических мутаций, что является основной причиной генетической нестабильности.

    Точное время деградации hTK1 и hTMPK гарантирует подавление dTTP во время митотической прогрессии

    Наше предыдущее исследование показало, что hTK1 является субстратом для APC/C-Cdh2, но не APC/C-Cdc20 E3 лигазы (Ke and Chang 2004).Поскольку TK1 является ферментом, ограничивающим скорость образования dTTP в пути спасения , нокдаун Cdh2 в этом исследовании привел к значительному увеличению dTTP в клетках. Однако было удивительно чтобы наблюдать, что нокдаун Cdc20 также увеличивает пул dTTP в клетках (Fig. 1A). Наши результаты показали, что APC/C-Cdc20 и APC/C-Cdh2 могут нацеливаться на деградацию hTMPK, распознавая его D-бокс, сайт D2. (рис. 6). Учитывая, что TMPK также необходима для образования dTTP по пути de novo, опосредованному TS, и что TS вряд ли будет Цель APC/C из-за отсутствия мотива разрушения в его аминокислотных последовательностях, APC/C-зависимая деградация TMPK будет, следовательно, они важны для контроля образования dTTP как по путям спасения , так и по путям de novo.В поддержку этой точки зрения наши данные показали, что подавление экспрессии TMPK полностью отменяет увеличение в пуле dTTP, индуцированном нокдауном Cdc20/Cdh2 (рис. 5).

    Рисунок 9.

    Нарушение APC/C-опосредованной деградации hTK1/hTMPK влияет на скорость роста и вызывает генетическую нестабильность. ( A ) Анализ роста различных клеток стабильной линии 3T3 (Mock, WT/WT и KEN/D2) проводили, как описано в разделе «Материалы и методы».Показанные здесь результаты представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. из трех отдельных экспериментов. ( B ) Различные клетки стабильной линии 3T3 (Mock, WT/WT и KEN/D2) (3 × 10 5 ) высевали на чашку для культивирования в среде, содержащей 6-TG (5 мкг/мл) (+ ) для анализа спонтанной мутации в локусе hprt . Для сравнения эффективности колониеобразования каждой линии 10 3 клеток выращивали параллельно в среде без 6-ТГ (–).

    Данные экспериментов по разложению in vitro и in vivo показали, что hTMPK расщепляется в фазе M до ранней G1, предшествующей разрушение hTK1 (рис.3). Уже было известно, что связывание Cdc20 с APC/C, запуская его активацию, происходит только во время митоза из метафазы. до телофазы, после чего следует Cdh2-опосредованная активация APC/C (для обзора см. Peters 2002). Наше наблюдение, что Cdc20 нацелен на TMPK, но не на TK1 для APC/C-опосредованной деградации, могло бы объяснить различия в экспрессии. уровни TMPK и TK1 в митотически заблокированных клетках, в которых экспрессия TMPK уменьшилась, в то время как высокие уровни TK1 все еще присутствовали.Теоретически более ранняя деградация TMPK обеспечивает низкий запас dTTP в митозе, при котором TK1 остается интактным. хоть и менее активно. Также обратите внимание, что присутствие Cdh2-опосредованного протеолиза поддерживает разрушение TMPK в ранней стадии G1. фаза. Таким образом, комбинаторная активность APC/C–Cdc20 и APC/C–Cdh2 обеспечивает деструкцию ТМПК на протяжении всего период митотической прогрессии. В соответствии с этим молекулярным контролем деградации TMPK мы обнаружили, что в клетках HeLa, Уровни dTTP оставались очень низкими при митотической остановке до середины фазы G1 следующего цикла, что совпало с колебанием паттерн экспрессии TMPK (фиг.4). Следует отметить, что хотя APC/C-Cdh2 нацеливает как TMPK, так и TK1 на деградацию в фазе G1, уровни экспрессии белка TMPK растут быстрее, чем у TK1 после выхода из митотического блока. Мы предполагаем, что это связано с тем, что уровни РНК TMPK увеличивались в середине фазы G1, тогда как уровень транскрипта TK1 не увеличивался до поздней фазы G1 (данные не показаны).

    Нарушение APC/C-опосредованного протеолиза TK1 и TMPK приводит к усилению дисбаланса пула dNTP

    Зная, что сайт D2 TMPK и KEN-бокс TK1 являются необходимыми мотивами для нацеливания на APC/C (рис.6), мы установили клеточные линии, коэкспрессирующие дикий тип (WT/WT) и недеградируемые (KEN/D2) hTK1 и hTMPK при сходных стационарных условиях. уровни. Как и ожидалось, клетки KEN/D2 содержали гораздо более высокий уровень dTTP, чем клетки WT/WT. Поскольку сывороточная депривация значительно снижение уровней экспрессии hTK1 и hTMPK и размер пула dTTP в клетках WT/WT, но не в клетках KEN/D2, потеря митотической деградации hTK1 и hTMPK должны быть основной причиной большего количества пула dTTP, накопленного в клетках KEN/D2 (рис.7Б). В соответствии с тем фактом, что dTTP может аллостерически регулировать субстратную специфичность rGDP и rCDP рибонуклеотида редуктазы (RNR) (Eriksson et al., 1979; Reichard et al., 2000), дисбаланс пула dNTP был в значительной степени усилен в клетках KEN/D2 из-за большей степени увеличения размера пула dGTP. и уменьшение пула dCTP. Поскольку уровни экспрессии hTK1 и hTMPK в клетках WT/WT и KEN/D2 были очень схожими наблюдаемым в клетках HeLaS3, K562 и HEK293T (данные не показаны), маловероятно, что наблюдается дисбаланс пула dNTP. в клетках KEN/D2 был результатом чрезмерной экспрессии hTK1 и hTMPK в нефизиологическом диапазоне.Следует отметить истощение Cdc20/Cdh2 в клетках HeLa приводит к еще большему дисбалансу пула dNTP из-за гораздо большей степени истощения dCTP и инкремент dGTP (рис. 8), что еще больше подтверждает идею о том, что подавление dTTP с помощью функции APC/C необходимо для поддержания сбалансированного dNTP. бассейн.

    Значение APC/C-опосредованного протеолиза TK1 и TMPK в клеточной пролиферации и целостности генома

    Увеличенный дисбаланс пула dNTP, наблюдаемый в клетках, совместно экспрессирующих недеградируемые hTK1 и hTMPK, явно приводил к замедлению роста.Анализ профиля клеточного цикла показал, что клетки KEN/D2 демонстрируют выраженную задержку перехода S → G2/M (данные не показаны). указание на остановку S-фазы. Хорошо известно, что обработка клеток высокими концентрациями тимидина останавливает вилку репликации ДНК из-за истощения dCTP (Studzinski and Lambert, 1969; Bjursell and Reichard, 1973; Bianchi et al., 1987). Следовательно, вполне вероятно, что в отсутствие контроля APC/C пул dTTP повышается до уровня, имитирующего результирующий от обработки тимидином, что приводит к замедлению синтеза ДНК из-за значительного снижения пула dCTP в этих клетках.Напротив, более высокая скорость роста наблюдалась в клетках, коэкспрессирующих как hTK1 дикого типа, так и hTMPK, в которых dTTP и dGTP пулы были повышены, а пул dCTP оставался таким же, как в ложных клетках. Этот результат подтверждает мнение о том, что замедленная прогрессия вилки репликации ДНК в результате повышения dTTP требует истощения dCTP (Bjursell and Reichard, 1973; Bianchi et al., 1987). Кроме того, это также предполагает, что сверхэкспрессия разлагаемых TK1 и TMPK производит dTTP в диапазоне, который не истощает dCTP, но увеличивает скорость синтеза ДНК, способствуя тем самым росту клеток.

    В этом исследовании мы также определили влияние нарушения APC/C-опосредованного контроля dTTP на генетическую стабильность путем анализа спонтанные мутации в локусе hprt . Клетки, коэкспрессирующие недеградируемые hTK1 и hTMPK, давали поразительное увеличение резистентных к 6-TG колоний по сравнению с без образования устойчивых к 6-TG колоний из клеток, коэкспрессирующих hTK1 дикого типа и hTMPK, в тех же экспериментальных условиях (Рис.9Б). Огромная разница в частоте мутаций между клетками KEN/D2 и WT/WT оказалась неожиданной. Мы повторили тот же эксперимент с клетками CHL V79 и получили практически такие же результаты (дополнительная рис. 5). Эти данные указывают на то, что пул dNTP дисбаланс, возникающий в результате нарушения деградации APC/C ТК1 и ТМПК, ухудшает точность синтеза ДНК, что, возможно, приводит к ошибкам репликации ДНК, продолжающим накапливаться во время медленного цикла роста.В связи с этим в нескольких недавних докладах показали, что репарация несоответствия и репарация гомологичной рекомбинации являются механизмами репарации ДНК, участвующими в реактивации остановленных клеток. вилки репликации из-за истощения dCTP, вызванного обработкой тимидином (Lundin et al. 2002; Mohindra et al. 2002, 2004; Bolderson et al. 2004). Поскольку произошло резкое увеличение частоты мутаций в клетках, экспрессирующих недеградируемые hTK1 и hTMPK, а также различные В этих клонах, устойчивых к 6-ТГ, были обнаружены типы мутаций в hrpt , вполне вероятно, что изменение (dGTP + dTTP)/dCTP в этих клетках нарушило достоверность синтеза ДНК до такой степени, что эти две системы репарации ДНК не могли этого сделать.

    С помощью дрожжей было продемонстрировано, что нарушение обратной связи ингибирования RNR приводит к увеличению уровня dNTPs и значительно способствует выживанию клеток после повреждения ДНК, в то время как скорость генной мутации в этих выживших клетках явно увеличивается (Chabes et al. 2003b). Таким образом, клетки, содержащие повышенные уровни пула dNTP, выживают при повреждении ДНК, но расплачиваются за это потерей точности. синтеза ДНК, что приводит к генетическим аномалиям.Это исследование предполагает, что регуляция пула нуклеотидов с помощью RNR у дрожжей может иметь важное значение для поддержания целостности генома. Наши данные, однако, также предполагают, что баланс пула dNTP у млекопитающих клетки могут быть защищены контролем APC/C посредством деградации TK1 и TMPK. Без этого контроля для подавления dTTP пула во время митотической прогрессии, в следующем клеточном цикле возникает серьезный дисбаланс пула dNTP, который вызывает генетические изменения приводя к генетической нестабильности, характерной для рака.Здесь мы предполагаем, что APC/C-опосредованная деградация TK1 и TMPK играет жизненно важную роль в обеспечении баланса пула dNTP во время митотической прогрессии, что необходимо для поддержания геномной честность.

    Материалы и методы

    Материалы

    Антисыворотку против hTMPK получали путем иммунизации кроликов очищенным белком GST-hTMPK и собирали, после чего поликлонировали антитело подвергали аффинной очистке.Специфичность очищенного антитела hTMPK была подтверждена анализом конкуренции антигена (дополнительная Рисунок 1). Поликлональное антитело против hTK1 получали, как описано ранее (Chang et al., 1994). Антитела против β-тубулина, против Flag и против Cdc27 были получены от Sigma. Анти-Cdc20, анти-секурин, анти-hrR2, анти-циклин B1 и антитела против myc были приобретены у Santa Cruz Biotechnology. Анти-НА получали от Roche. Анти-GFP и анти-циклин Антитела А1 были приобретены у Clontech и Transduction Laboratories соответственно.Антитела к Cdh2 и анти-GST были получены от Oncogene и Amersham Pharmacia соответственно. G418 и зеоцин были приобретены у Invitrogen. нокодазол и 6-тиогуанин были приобретены у Sigma. LLnL был получен от Calbiochem.

    Конструирование экспрессионных плазмид и сайт-направленный мутагенез

    pCDNA3.1Zeo-hTMPK получали путем вставки BamHI-фрагмента pGEX-2T-hTMPK (предоставлено Jin-Yuan Su, National Yang Ming Университет, Тайвань) в плазмиду pCDNA3.1Зео. Фрагмент ДНК, содержащий кДНК hTMPK, был получен с помощью ПЦР-амплификации с использованием pGEX-2T-hTMPK в качестве матрицы и затем субклонировали в сайт HindIII плазмиды pCMV2FLAG с получением pCMV2FLAG-hTMPK. Мутации hTMPK были созданы с использованием набора для направленного мутагенеза Quick-Change Site-directed Mutagenesis (Stratagene) с использованием специфических мутантных праймеров. Конструирование экспрессионной плазмиды hTK1 было описано ранее (Ke and Chang 2004). pHA-Cdc20 и pHA-Cdh2 были предоставлены Kristian Helin (Европейский институт онкологии, Милан, Италия).Мышь E1 и UbcX экспрессионные плазмиды были предоставлены Tim Hunt (ICRF Clare Hall Laboratory, South Mimms, United Kingdom). Плазмиды Ubc10 человека, включая дикий тип и мутант C114S, были предоставлены Джоан В. Рудерман (Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс). pCS2-Myc-Cdc20 и pCS2-MycCdh2 были предоставлены Marc W. Kirschner (Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс). Бакуловирусная экспрессия pFASTBacHis-Cdc20 и pFASTBacHis-Cdh2 были предоставлены Jan-Michael Peters (Научно-исследовательский институт молекулярной биологии, Вена, Австрия).

    Культура клеток, синхронизация, трансфекция, анализ роста и анализ FACS

    Клетки

    HeLa, HeLa S3, LM-TK и NIH 3T3 содержали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM, Life Technologies) с добавлением 10% эмбриональная бычья сыворотка плюс 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ЕД/мл пенициллина (Life Technologies) при 37°C и 5% CO 2 . Для ареста G2/M к субконфлюэнтным клеткам HeLa S3 добавляли нокодазол в конечной концентрации 0.5 мкг/мл в течение 20 часов. Чтобы получить В ранней фазе G1 клетки с митотической остановкой стряхивали, промывали PBS и инкубировали в свежей среде в течение дополнительного времени. 3–5 ч. Для экспериментов по эктопической экспрессии клетки, высеянные на чашку диаметром 60 мм, трансфицировали смесью, содержащей 3 мкг ДНК и 18 мкг липофектамина (Invitrogen) согласно инструкции производителя. Для измерения темпов роста клетки высевали с плотностью 1 × 10 5 клеток в 10-сантиметровую чашку и подсчитывали каждый день с использованием метода исключения красителя трипанового синего в течение 6 дней.Анализ FACS был выполнен как описано ранее (Ке и Чанг 2004). Клетки фиксировали в 70% (об./об.) этаноле и профиль клеточного цикла исследовали с использованием проточного цитометра Becton Dickson FACScan. и программное обеспечение CellQuest.

    Эксперимент с погоней за импульсами

    Для метаболического мечения клетки дважды промывали PBS и инкубировали в 5 мл DMEM без метионина в течение 1 ч депривации.Затем клетки инкубировали в 2 мл свежей DMEM, не содержащей метионин, содержащей диализованный 10% FBS и 35 S-метионин (500 мкКи, Amersham Pharmacia) в течение 30 мин. Чтобы прекратить мечение, добавляли полную среду DMEM для 0- и 12-часовая погоня перед сбором урожая. Лизаты клеток, меченных S-метионином 35 , подвергали иммунопреципитации hTK1 и hTMPK с последующим SDS-PAGE, вестерн-блоттингом. анализа и авторадиографии.

    Эксперименты с РНК-интерференцией

    Было проведено

    эксперимента по РНК-интерференции, как описано ранее (Ke and Chang 2004). siRNAs против Cdc20 и Cdh2 были синтезированы в соответствии с последовательностями, описанными в предыдущих исследованиях (Donzelli et al. 2002; Wei et al. 2004). siРНК против hTK1 и hTMPK были приобретены в пулах Dharmacon si Genome SMART. Контрольные siРНК против люциферазы светлячка были получены от Dharmacon.Трансфекцию siРНК проводили с использованием олигофектамина (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя.

    Экспрессия и очистка рекомбинантных белков

    Белки

    GST-hTMPK и GST-циклин B1 были экспрессированы в Escherichia coli JM109, очищены гранулами глутатиона 4B и расщеплены тромбином в соответствии с инструкциями производителя. GST-hTK1, His-мышь E1, His-UbcX и His-Ubch20 очищали, как описано ранее (Ke and Chang 2004).His-Cdc20 и His-Cdh2 экспрессировали и очищали в бакуловирусной системе в соответствии с исследованием, описанным Kramer et al. др. (1998).

    Анализ деградации in vitro, полиубиквитинилирования in vitro и анализ связывания in vitro

    Приготовление синхронизированных клеточных экстрактов для экспериментов in vitro и анализа деградации in vitro проводили, как описано ранее (Брандейс и Хант, 1996).Один микролитр 35 S-метионин-меченого in vitro транслированного Myc-меченого hTMPK добавляли к 10 мкл клеточных экстрактов с добавлением регенерирующей энергии (100 мкг/мл циклогексимида, 2,5 мМ АТФ, 80 мкг/мл креатинкиназы, 40 мМ креатинфосфата) и инкубировали при 30°C с последующим взяв 1 мкл образцов для SDS-PAGE и авторадиографии. Для конкуренции митотические экстракты и экстракты фазы G1 инкубировали. с 5 мкг очищенного GST-циклина B1 и GST-hTK1 соответственно для 0.5 ч при 4°C перед анализом деградации in vitro. Очищение APC/C методом иммунопреципитации проводили согласно предыдущему исследованию (Kramer et al., 1998). Анализ полиубиквитинилирования in vitro проводили, как описано ранее (Ke and Chang 2004). Вкратце, гранулы APC/C активировали путем инкубации с очищенным His-Cdc20 или His-Cdh2 в течение 1 ч при 25°C, а затем добавляли в реакционную смесь, содержащую 200 мкг/мл мышиного E1, 100 мкг/мл UbcX или Ubch20, 1.25 мг/мл убиквитина, 100 нг субстрата, и система регенерации энергии общим объемом 5 мкл. Все реакционные смеси инкубировали в течение 1 ч при 37°С, после чего реакционные смеси анализировали с помощью SDS-PAGE с градиентом 5–15% и вестерн-блоттинга.

    Определение пула дНТФ в экстракте целых клеток

    Клетки (5 × 10 6 ) дважды промывали 10 мл холодного PBS и экстрагировали 1 мл охлажденного льдом 60% метанола в течение 1 ч при –20°C с последующим центрифугированием. в течение 15 мин при 14000×g.Супернатант переносили в свежую пробирку и сушили в вакууме. Остаток растворяли в 200 мкл стерильной воды и хранят при –20°С для последующего анализа. Определение размера пула dNTP в каждом экстракте основанный на катализируемом ДНК-полимеразой включении радиоактивного dNTP в синтетический матричный метод олигонуклеотидов, описанный Шерман и Файф (1989). Реакционная смесь (20 мкл) содержала 100 мМ буфера HEPES (pH 7.5), 10 мМ MgCl 2 , 0,5 ед. ДНК-полимеразы I E. coli Klenow (Promega), 0,25 мкМ олигонуклеотидной матрицы, 1 мкл экстракта dNTP и 8,32 нМ 3 H-dATP ( для dTTP, dCTP и dGTP) или 3 H-dTTP (для dATP). Инкубацию проводили в течение 60 мин при 25°С и наносили на бумагу DE81. Бумаги были высушены, вымыты (3 × 10 мин) с 5% Na 2 HPO 4 и один раз промывали дистиллированной водой и один раз 95% этанолом.После сушки измеряли радиоактивность бумаги в жидкостный сцинтилляционный счетчик (Бекмана).

    Создание стабильных клеточных линий

    клеток NIH 3T3 первоначально культивировали в среде с добавлением HAT (100 мкМ гипоксантина натрия, 0,4 мкМ аминоптерина, 10 мкМ тимидина) в течение двух поколений перед использованием в экспериментах по стабильной трансфекции. Эта процедура гарантирует, что клетки содержат ген hprt дикого типа.Для стабильной трансфекции клетки NIH 3T3 трансфицировали pCDNA3.1Neo-hTK1 или pCDNA3.1Zeo-hTMPK соответственно. Одновременный экспрессию hTK1 и hTMPK достигали котрансфекцией pCDNA3.1Neo-hTK1 и pCDNA3.1Zeo-hTMPK в клетки NIH 3T3. После трансфекции клетки отбирали в среде, содержащей G418 (600 мкг/мл, для hTK1) и зеоцин (800 мкг/мл, для hTMPK1). на 14 д. Клоны, устойчивые к антибиотикам, были отобраны, размножены и далее культивированы в среде, дополненной достаточным количеством количества антибиотиков.

    Анализ спонтанного мутагенеза гена hprt

    Анализ спонтанного мутагенеза гена hprt проводили аналогично методу, описанному в предыдущем исследовании (Dare et al. 1995). Клетки высевали при низкой плотности (10 3 клеток/чашку) и выращивали до плотности 10 6 клеток на чашку перед отбором, чтобы свести к минимуму агрегацию между различными клеточными клонами в наших экспериментальных условиях.Клетки (3 × 10 5 ) затем высевали на 10-мм чашку в полной среде с добавлением 6-тиогуанина (6-ТГ, 5 мкг/мл) на 10 дней. Измерять эффективность образования колоний, 10 3 клеток параллельно высевали на другую 10-мм чашку в среде без 6-ТГ. Колонии фиксировали ледяным метанолом. и окрашивали 0,5% кристаллическим фиолетовым. Колонии, устойчивые к 6-ТГ, выделяли и размножали с последующим приготовлением РНК для последующая ОТ-ПЦР hrt мРНК.Затем продукты ПЦР очищали от агарозного геля и подвергали прямому секвенированию ДНК.

    Благодарности

    Мы благодарим Кристиана Хелина за любезно предоставленные Cdc20 и Cdh2 с меткой HA и Марка В. Киршнера за предоставление Cdc20 с меткой Myc. и конструкции Cdh2. Мы благодарны Wu-Nan Wen, Jin-Yuan Su и Maria Zajac-Kaye за предоставленную клеточную линию CHL V79, GST-hTMPK, и пКДНК3.1Zeo соответственно. Мы признательны Тиму Ханту, Джоан В. Рудерман и Яну-Майклу Петерсу за предоставление мышиных экспрессионных плазмид E1, Xenopus UbcX, E2C/Ubch20 человека с мутацией C114S, а также экспрессионных плазмид Cdc20 и Cdh2 с меткой His. Мы ценим Михаила Brandeis и Ambrose Jong за полезные обсуждения. Мы также благодарим докторов. Ruey-Hwa Chen и Jeou-Yuan Chen за критическое чтение рукописи. Это исследование было поддержано грантами NSC93-2752-B002-006-PAE и NSC94-3112-B-002-025 от National Science. Совета и NHRI-EX94-9421BI от Национального научно-исследовательского института здравоохранения, Тайвань (R.О.С).

    Сноски

    • Дополнительный материал доступен на http://www.genesdev.org.

    • Статья и публикация находятся по адресу http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.1322905.

    • ↵1 Автор, ответственный за переписку.

      ↵1 ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА zfchang{at}ha.mc.ntu.edu.tw; ФАКС 886-2-2395-8904.

      • Принят 22 июня 2005 г.
      • Поступила в редакцию 11 апреля 2005 г.
    • Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор
    .

    Написать ответ

    Ваш адрес email не будет опубликован.