Нлпи это: ТОП-7 НЛП-техник на каждый день для манипулирования людьми

Содержание

НЛП и манипуляция | Ресурсы НЛП

Егор Булыгин

Что такое НЛП

Если посмотреть количество запросов слова «НЛП» в поисковиках, то можно заметить, что массовый интерес к НЛП довольно высок. Впрочем, это вполне понятно. Во-первых, НЛП на сегодняшний день самое методичное и самое практикоориентированное направление из всей психологии. И, во-вторых, что более важно, НЛП не так ограничено, как другие психологических направления привязкой к терапии, и имеет множество технологий ориентированных на применение в деловом и повседневном общеннии, управлении, продажах, рекламе, пропаганде и других видах коммуникации, где используется психологическое воздействие.

Однако, чтобы у читателей не сложилось мнение, что НЛП это психологический «скальпель-ракетница» ;), расскажу в двух словах что это за три буквы (подробнее о том, что такое НЛП, вы можете узнать здесь).

Изначально, НЛП возникло как продукт моделирования работы психотерапевтов, наиболее успешно производящих изменения в сознании пациентов. Милтона Эриксона, автора и создателя эриксоновского гипноза, тоже моделировали, и это объясняет наличие множества общего у этих технологий. Однако, если эриксоновский гипноз, это технология для совершения изменений в сознании, то НЛП, это система, объединяющая в себе множество различных технологий единым языком описания, позволяющим работать с набором этих технологий, как с одной.

И, если посмотреть на НЛП с научной стороны, то наиболее точным определением для него будет «эпистемология» — наука о том, как мы знаем и как познаем. А если посмотреть с практической стороны, точное определение НЛП представлено в самом его названии — нейро-лингвистическое программирование, т.е. программирование психических процессов посредством речи.

Правда, ограничение «посредством речи» устарело практически сразу, так как НЛП стало использовать все каналы восприятия и невербальную коммуникацию. Но, как бренд, слово «НЛП» уже состоялось. 😉

После всего вышесказанного, думаю, однозначно ясно, НЛП и гипноз, помимо прочих возможностей, дают так же и отличные возможности для манипуляции — т.е. оказания явного или скрытого психологического воздействия на сознание человека или общественных масс. И теперь, я думаю, для продолжения дальнейшего разговора про НЛП и гипноз, крайне необходимо разобраться с вопросом манипуляции.

Манипуляция

Я бы хотел обратить ваше внимание на такое распространенное убеждение, что манипуляция, это плохо. Манипуляция, это действительно плохо, но только тогда, когда вы не берете на себя ответственность за то, что вы делаете. Потому что в действительности, манипуляция, это то, что мы все время делаем друг с другом, когда общаемся.

Сейчас объясню подбронее.

Общаясь, люди всегда, причем, как правило, бессознательно, стремятся получить от собеседника какую-либо реакцию, начиная от простого внимания, заканчивая одобрением, согласием или каким-либо поведением. Поэтому любое общение, если оно не пассивно на 100%, уже будет манипуляцией.
Так что если у вас есть какие-либо цели, связанные с другими людьми (а это все цели, которых вы не можете достичь в одиночку — почти все цели современного социального человека), то общаясь с ними, вы будете вынуждены ими манипулировать. Иначе просто не будете достигать своих целей.

Мы все постоянно друг другом манипулируем, сознательно или бессознательно это происходит, это не имеет значения. И утверждать же, что этого не происходит, значит спихивать с себя ответственность.

И еще один момент. Явной, или скрытой будет манипуляция — не имеет особого значения, так как перед каждым своим дейстием, жестом или словом, говорить собеседнику, какую реакцию мы от него хотим получить, согласитесь, будет абсурдно. И, в то же время, от того что вы сначала скажете человеку, чего вы от него хотите, а потом сделаете все, чтобы это получить, это не престанет быть манипуляцией. Просто это будет открытой манипуляцией, вот и все.

Поэтому давайте просто признаемся себе (если мы это еще не сделали ;)), что мы манипулируем друг другом, и просто возьмем на себя ответственность за свои действия. Это будет, как минимум честно.

Этика манипуляции

Если уж так получается, что если мы общаемся, то мы не можем не влиять друг на друга, то как же теперь быть? В смысле, если уж я все равно манипулирую, то как мне это делать, чтобы это не было нехорошо для других?

Ответ очень простой, и известен испокон веков: поступай с другими так, как хотел бы, чтобы другие поступали с тобой.

…Стоп! Это не значит, что нужно навязывать всем то, что хочешь сам 😉 Все люди разные, и у всех свои цели, ценности и желания. Поэтому принцип гармоничного общения (или экологичной манипуляции), это уважение чужих целей, ценностей и интересов.

Для этого достаточно просто задуматься на секундочу: «А мне бы на его(ее) месте понравилось бы такое действие в мой адрес?». И все, и вы получаете ответ на вопрос, этична ли ваша манипуляция, или, проще говоря, хорошо ли вы поступаете с этим человеком в этой ситуации. Главное, это быть честным с самим собой, задавая этот вопрос. Иначе он не имеет смысла.

Гложет меня чувство, дорогие читатели, что в прошлом выпуске я рассказал про манипуляцию не все, что нужно для целостного понимания этого вопроса. Будем наверстывать упущенное 🙂

В прошлом выпуске, как вы помните, основные тезисы были такие:
Если ты общаешься с людьми и хотя бы отвечаешь им (не говоря уже об активности), ты уже оказываешь влияние. Любая информация оказывает влияние.
Когда ты достигаешь каких либо целей, связанных с другими людьми, ты не можешь не манипулировать ими (неважно, открыто или неявно). Учитывая, что цели есть у всех (т.к. потребности есть у всех от природы), каждый из нас вынужден манипулировать друг другом, и делает это с успехом с самого рождения.
Манипуляция становиться злом, когда человек не берет на себя ответственность за совершенные им действия.

Из этих тезисов логично вытекает главный, к которому я и веду:

Вы можете делать все что угодно, при условии, что вы берете на себя ответственность за свои действия.

Понимаю, что фраза «все что угодно» может вызвать некоторое не согласие: «Постойте-ка, а как же мораль? А как же общественные ценности?» Мне понятно это несогласие, и все же я настаиваю на личной ответственности взамен общественнх ценностей. Дело в том, что мы с вами живем в весьма фрагментированом обществе (к тому же еще и поделенном на социальные классы), где тесно соседствует множество разных культур, пропагандирующих совершенно разные, а иногда и прямо противоположные ценности. И если ценности высокго порядка (первые три-четыре) у нас могут более или менее совпадать, то все остальные будут уже сильно различаться, причем даже у людей из одного общества. Просто потому что каждый из нас принадлежит к нескольким обществам сразу и имеет свою систему ценностей. И не наступить на «общественные» ценности человека, стремясь к своим «общественным» ценностям, практически невозможно. (На этих граблях, кстати, и висит большая часть неразрешенных конфликтов общественного характера.) Поэтому, мораль, построенная на ценностях в нашем культурно фрагментированном обществе просто не работает — тонны горького опыта тому доказательство. И поэтому я говорю о личной ответственности.

И тут возникает один замечательный вопрос. А что если я не буду брать на себя ответственность за свои действия, и буду делать все что хочу? Или аналогичный ему: «Да фиг с ней с ответственностью, кто узнает? Кто спросит? Кто?!… Да я его тогда…!».

И вот тут мы подходим к главному, что необходимо понимать в вопросе манипуляции.

Системные эффекты

То, что любое действие будет иметь последствия (вопрос, какие?), понимают все. А вот то, что это правило относится к каждому нашему действию, к сожалению, люди не всегда помнят.

А бывает так: поблагодарил коллегу за случайный комплимент, ему стало приятно, и он обмолвился в разговоре в курилке, что вы «свой парень» и ненроком поднял ваш «рейтинг». А когда стали решать всем отделом, кого из передовиков путевкой поощрить, за тебя вдруг проголосовало больше.

Или не поблагодарил коллегу за тот же комплимент, и там где тебя должно было ждать «везение», его просто не случилось.
Точно так вы можете где-то с кем-то согласиться просто из вежливости и уважения к чужой точке зрения, и потом он согласиться с вами, когда вы будете шефу презентовать свой новый проект.

В НЛП такие «последствия» называются — системные эффекты (когда взаимодействие людей рассматривается, как взаимодействие элементов одной системы). Просчитать их полностью не возможно, но предугадать очевидные или предположить тенденции — вполне реально. И, я думаю, вполне понятно, почему нам выгодно создавать больше позитивных системных эффектов и меньше негативных 🙂 И я думаю, из примера понятно, как это можно делать 😉

Но это еще не все. Информация имеет тенденцию накапливаться в сознании людей и в «общественных архивах», вроде форумов, писем, публикаций и т.д. И скопившись, она становиться самоподдерживающейся. Знакомая ситуация: «Да разве ж он мог такое сказать?! Я его давно знаю! Это не в его стиле.»? Сложившаяся репутация заставляет людей верить в то, к чему они привыкли и будет поддерживать эту веру. Такова природа человеческого мышления.
Как говорил Михайл Романович Гинзбург (большой специалист и мой учитель по Эриксоновскому гипнозу): «Сначала вы работаете на зачетку, а потом зачетка работает на вас».

Таким образом, выходит, что системные эффекты наших сегодняшних дел могут вернуться к нам сегодня же, а могут где-то накопиться и аукнуться лет через пять. И если мы хотим получить какой-либо эффект как можно быстрее, нужно просто быстрее и больше «нароботать» «зачетку». И наоборот, если мы не хотим получать этот эффект.

Однако стоит помнить, что от одного действия системных эффектов может быть несколько. И, создавая одни эффекты, «в нагрузку» мы можем получить еще и другие. Так, выслуживание перед начальством может принести вместе с расположением шефа и отдаление коллег. Имидж успешного работника — вместе с предпочтением руководства, завиcть менее успешных но не менее амбициозных сослуживцев. Изобильное внимание к клиенту вместе с его расположением и повышенные требования к обслуживанию, а то и к цене.

Поэтому, чтобы учитывать максимум возможных эффектов, стоит делать две вещи:
Вставать на позицию человека (группы), к которому обращена коммуникация, и из его позиции смотреть, устроит ли его эта коммуникация в это время, в этом месте и в этой ситуации?
Вставать на позиции всех остальных участников коммуникации, и смотреть, все ли устроит их в этой ситуации?

Но ведь, возникает вопрос, сделать так, чтобы не вызвать негативных эффектов, во многих случаях просто невозможно? Например, как только ты становишься богатым, десятки людей начинают тебе завидовать. Или, если у тебя есть конкуренты в бизнесе, то привлекая рекламой клиента к себе, ты лишаешь его конкурента. Разве не так?

Да. Так. И здесь самое время вспомнить о разделении ответственности. Одно дело, чье-то недовольство по поводу твоего успеха, и другое — чье-то недовольство в следствие твоего успеха.

Иными словами, если ваш успех достигается за счет того, что кто-то что-то теряет, не получая ничего достойного взамен — это не успех, а кража. (Не покупайте рыбу у Василия, она у него костлявее, чем у меня. :))

А если вы достигаете успеха при равноценном обмене (на который согласились бы сами), тогда это честный успех. (Если вы купите рыбу у меня, то я вам, как своему клиенту, дам уникальный рецепт таежной ухи, доставшийся мне по наследству от дедушки — большого специалиста по рыбе. :)) Или, раз уж мы говорим о манипуляции — честная манипуляция.

Но как это связано с системными эффектами? Очень просто. Помните закон сообщающихся сосудов? Чтобы из одного сосуда вода перешла в другой, нужно, помимо прочего, еще и чтобы из другого сосуда часть воздуха перешла в первый. Иначе разница в давлени просто не пустит воду.
(Нет, с усилием, конечно можно сделать все, но представьте, какую это зарядит «пружину»! И как она потом «выстрелит»! :))

Так вот, это так же и один из законов системной к коммуникации. В общении невозможно что-то получить, не отдав ничего взамен, и, как ни странно, невозможно ничего отдать, не получив ничего за это 🙂 Вопрос лишь в том — что?

Стратегия «выигрыш-выигрыш»

Зачем заставлять человека что-то делать, когда можно просто вызвать у него желание к этому? Понятно, что заставить проще, но ведь при этом и намного дороже. Может быть не сразу, но в так в будущем. (Если не понятно, почему дороже, перечитайте предыдущие два абзаца :))

Впрочем, когда у человека в руках пистолет, а на шее петля, и таймер отсчитывает оставшееся ему время, я могу понять его попытки заставить кого-то что-то сделать. Но если это просто семейный разговор, или обычная рабочая ситуация?

В любых отношения всегда существует внегласный контракт. (А то и гласный. :)) И если один человек согласился сделать что-то для другого, то он сам от этого что-то получает.
И, скажу сразу, бескорыстности тут не бывает, потому что сама идея «быть бескорыстным» уже корыстна.
А если кто-то что-то делает другому «за так», то ему самому либо прикольно это делать, либо полезно, либо он это делает все-таки не совсем «за так» 😉
И, здесь совершенно справедливо, что многие люди (и я в том числе) получают искреннее удовольствие делая другим подарки. Казалось, что бескорыстнее?

Так вот, стратегия «выигрыш-выигрыш» заключается в том, что мы не заставляем человека думать, какие выгоды он получит, от того что сделает то, что нам нужно, а просчитываем его выгоды сами и просто предлагаем их ему вместе с просьбой или «контрактом». Знакомые примеры: «ты гулять пойдешь, как сделаешь уроки, или сейчас? Сейчас? Возьми тогда собаку, пожалуйста.»?
Или: «Пиво с креветками хочешь? Я дам денег, сходи пожалуйста.»
Примерно по той же схеме работает популярная во многих компаниях стратегия «проталкивания» своего проекта: «Шеф, вы на той неделе классную идею подали! Я нашел способ ее реализовать…» 🙂

В бизнесе стратегия «выигрыш-выигрыш» — это чистая продажа. Любой мало-мальски грамотный продавец знает, что люди покупают не товар, а выгоды, которые он им принесет. Поэтому классическая схема продаж начинается с выявления потребностей клиента, или определения контекста использования товара, что тоже самое.

Как видите, «выигрыш-выигрыш», это тоже манипуляция. Причем, порой, в особо крупных масштабах 😉 Но, манипуляция, надо заметить честная. И я не буду вас спрашивать, почему 😉

Источник: nlping.ru

5 мифов про НЛП с которыми давно пора распрощаться

НЛП, нейролингвистическое программирование — три буквы, два слова, а сколько споров разворачивается на информационном поле битвы, сколько мифов и стереотипов летают над бьющимися, иногда садясь им на головы! А действительно, сколько? И главное: какие? О мифах, истории происхождения, а также о том, почему НЛП — это ключевой инструмент обучения, и пойдет речь.

Photo by Olav Ahrens Røtne on Unsplash

НЛП — это искусство изменения себя и гармоничной коммуникации с собой и миром, а также набор практических инструментов из разных областей психологии.

Три кита держат НЛП на своих могучих спинах:

Нейрофизиология

Как известно, всю информацию об окружающем мире мы считываем с помощью пяти органов чувств. Приставка «нейро-» указывает на отношение к нервной системе и означает закодированный телесный опыт.

Изучает языки. Один из создателей НЛП, Джон Гриндер, изучал лингвистические паттерны, в которых мы шифруем свои смыслы и ценности.

В контексте НЛП, означает порядок действий. Сюда относятся наши успешные и не очень действия и способы мысли.

Так о чем же ведутся споры? Что так пугает некоторых в НЛП? А пугает огромная пропасть предрассудков.

5 распространенных мифов про НЛП

МИФ 1: Обман и манипуляция

У некоторых людей в головах прочно засела ассоциация: НЛП — это способ взять под контроль и манипулировать мозгом другого человека («программирование» ведь, да еще и «нейро-»!).

Но правда в том, что любая коммуникация есть манипуляция.

Дело не в обмане и не в злом умысле, а в свойствах нашего мозга: взаимодействуя с другими, мы стремиться оказать на них влияние. Оно может быть каким угодно: «Привет» в ответ на ваше приветствие или «Прости» на обвинение, внимание к вашей истории или поддержка после рассказа о наболевшем. Иногда мы осознаем, какое конкретно поведение хотим получить от другого человека, а иногда действуем бессознательно: нажимаем на незнакомые кнопки, вызывая ту или иную реакцию.

Чему учит НЛП, так это уметь находить связь между кнопкой и реакцией, а еще оно дает необходимый инструментарий для эффективного взаимодействия с другими людьми (но в первую очередь с собой, своими эмоциями, состояниями и реакциями).

Чтобы иностранец вас понял, нужно перейти на его язык — это очевидно. Гораздо менее очевидно, что все мы друг для друга словно иностранцы, со своими убеждениями, ассоциациями и представлениями о мире. Уметь «переходить на язык» другого человека, чтобы договариваться, — это еще один навык, который можно развить с помощью НЛП.

Иначе получается, как в притче про слона и слепых мудрецов:

МИФ 2: Психологи не признают НЛП

НЛП — это часть практической психологии. Впрочем, его активно используют не только психологи и психиатры, но еще политики и опытные переговорщики. Дело в том, что буквы Н, Л и П, когда собираются в единую аббревиатуру, часто пугают или вводят в заблуждение клиента, поэтому психотерапевту легче провести технику, не уточняя, что та относится к НЛП. Это как с гипнозом: повесьте сертификат о прохождении курса на дверь, и ваш кабинет будут обходить десятой дорогой, да еще и в шапочках из фольги.

Погрузившись в тему, вы начнете замечать, как тесно переплетается нейролингвистическое программирование с другими направлениями психологии, и как много людей, в том числе публичных, его используют.

МИФ 3: НЛП не работает

Единственное есть лекарство от этой напасти — убедиться в «рабочести» на собственном опыте. Можно бесконечно долго наблюдать за знакомыми, которые изучают в НЛП, а их жизнь при этом улучшается, и списывать это на удачу, совпадение; можно читать статьи, цокать языком и говорить: «ну бред же» — это, пожалуйста, в любое время и в любых количествах.

Но, а вдруг работает? Вдруг одна из техник ляжет недостающим пазлом в вашу жизнь, а новое убеждение позволит увидеть возможности, на которые раньше не хватало смелости поднять глаза? Ведь кому-то легло, кто-то разглядел эти самые возможности, а раз получилось у него, то получится и у вас — базовая пресуппозиция НЛП.

МИФ 4: Это опасно

У техник НЛП есть один простой принцип: всё что переставили и поменяли, можно вернуть на прежнее место. Другой вопрос: захочется ли?

Кроме того, если вы откроете любое пошаговое описание техники, то в конце там всегда значится пункт «Проверка экологии». Проверка простая, всего один вопрос: «Как себя чувствуете?» Если что-то не так, то технику доделывают или меняют так, чтобы самочувствие в конце вас устраивало. Но даже если в долгосрочной перспективе техника дала не тот эффект, который задумывался, то вернемся к пункту первому: всё можно вернуть на прежнее место.

МИФ 5: «Зомбирование» и гипноз

В недавней статье «Транс: страшно или полезно?» мы разобрались, что гипноз к зомбированию имеет весьма опосредованное отношение, и даже более того — полезен для человека и широко применяется в психотерапии. Но какое отношение он имеет к НЛП?

Одно дополняет другое. Техники НЛП работают еще лучше в сочетании с трансовым состоянием, появляется возможность взаимодействовать со своим бессознательным на более глубоком уровне. И наоборот: гипнотерапия только обогатится, если добавить в нее контекст нейролингвистического программирования. Это и неудивительно: в его основу легла психотерапевтическая модель Милтона Эриксона, всемирно известного гипнотерапевта.

Пример: если уметь вводить себя в состояние транса, то можно провести технику Реимпринтинг Формата, не поднимаясь с кресла.

Пошаговое описание техники в статье: Реимпринтинг: техника, меняющая жизнь

Вернемся в самое начало: История НЛП

Начало 70-тых годов. Санта-Круз, штат Калифорния. Ричард Бэндлер, студент математического факультета, решает изучать психологию и обнаруживает, что в работе выдающихся психотерапевтов того времени есть некие шаблоны, и если их повторять, то можно достичь пусть не таких же, но подобных результатов в терапии. Позже это станет основой моделирования, которое изучают на мастерском курсе.

Потом он знакомится с Джоном Гриндером, ассистентом профессора лингвистики. Гриндера занимает идея связи между речью, мышлением и действиями. Вместе они изучают работу трех великих психотерапевтов:

Вирджиния Сатир — одна из наиболее влиятельных личностей в семейной психотерапии;

Фриц Перлз — основоположник гештальт-терапии;

Милтон Эриксон — выдающийся американский психиатр и гипнотерапевт.

Так, на стыке, казалось бы, полярных областей — информатики, лингвистики и психологии, родился проект под названием «НЛП».

Позже на основе этих разработок были созданы базовые программы – курсы НЛП Практик и НЛП Мастер.

НЛП Практик — это курс, с которого принято начинать изучение НЛП. Практики знакомятся с основами и базовыми методиками нейролингвистического программирования. Сюда входят техники для смены состояния, достижение целей, разрешения внутренних и внешних конфликтов, проработка своих ограничивающих убеждений, работа с частями личности, присвоение опыта и т.д.

НЛП Мастер — курс, на который идут после Практика. Мастера намного глубже прорабатывают свои вопросы и свою жизнь. На курсе они осознают свое Предназначение, овладевают инструментами моделирования успешных стратегий и создания новых навыков.

К слову, о моделировании.

Что же такое моделирование?

Какую суперспособность вы бы хотели? Только обойдемся без полётов и невидимости. Сегодня мир пестрит умениями и талантами, едва ли найдется человек без единой «суперспособности». Кто-то эффектно выступает перед аудиторией, а у кого-то хорошо получается себя дисциплинировать. И наверняка вы знаете такого человека, чей навык с удовольствием присвоили бы себе.

Именно этим и занимается моделирование: раскладывает нужную способность на элементы, а потом собирает ее по-новому, адаптируя под вас.

Так работает любая система обучения. Прежде чем вы станцуете вальс, вас научат становиться в правильную позу, стоять в ней какое-то время, потом делать маленькие шажки вперед-назад и в стороны, затем повороты, и только после этого движения будут постепенно складываться в цельный танец. Отличие от моделирования лишь в том, что смоделировать чужое умение можно в очень короткие сроки.

НЛП — это ключевой инструмент обучения.

Зачем нужно НЛП?

Ответ на вопрос «Зачем нужно НЛП лично вам?» знаете только вы сами. Но вот лишь меньшая часть того, что вам способно предложить нейролингвистическое программирование:

умение управлять своими эмоциями;
умение осознанно влиять на людей, убеждать их, навык переговоров;
навык быстрой адаптации к новому окружению или условиям;
умение моделировать и быстро осваивать любые навыки;
способность быстро восстанавливать энергию;
умение понимать истинные намерения людей и противостоять гипнотической речи;
работа с убеждениями и умение находить среди них ограничивающие;
умение менять состояние (на уверенное, сконцентрированное, спокойное и т.д.).

И многое другое, актуальное или неочевидное, что может пригодиться в самый неожиданный момент. Как было у Стива Джобса?

«Вы не можете соединить точки, смотря вперёд; вы можете соединить их, только оглядываясь в прошлое. Поэтому вам придётся довериться тем точкам, которые вы как-нибудь свяжете в будущем.»

Только оглянувшись назад, многие НЛП практики, мастера и тренеры понимают, как же круто повернула их жизнь с лесной тропинки на многополосное шоссе.

А начать изучать НЛП можно в любое время в любом месте с помощью онлайн видеокурса НЛП Практик Базовый

Полный видеокурс состоит из восьми частей. Несмотря на то, что все части логически выстроены в последовательный курс, обучение можно начинать самостоятельное с любой из них.

Наша бесплатная энциклопедия нейролингвистического программирования: НЛП Wiki

Статья создана специально для сайта alunika.com Полиной Данкович

Также читают:

НЛП аксиомы — список пресуппозиций для счастливой жизни

Раппорт и подстройка: как стать тем, кому доверяют

Техника ХСР: вот как правильно ставить цели

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter (на Mac тоже Ctrl+Enter). Спасибо!

Закладка0
Почему НЛП — это ключевой инструмент обучения в наше время
Давайте с места в карьер.
Что такое НЛП?
Нейролингвистическое Программирование (НЛП) — это искусство изменения себя и гармоничной коммуникации с собой и миром, а также набор практических инструментов из разных областей психологии.
Как это явствует из названия, НЛП технология основана на трех основных элементах:
Нейрофизиология
Как известно, всю информацию об окружающем мире мы считываем с помощью пяти органов чувств. Приставка «нейро-» указывает на отношение к нервной системе и означает закодированный телесный опыт.
Изучает языки. Один из создателей НЛП, Джон Гриндер, изучал лингвистические паттерны, в которых мы шифруем свои смыслы и ценности.
В контексте НЛП, означает порядок действий. Сюда относятся наши успешные и не очень действия и способы мысли.
Photo from Unsplash
Проект под названием «НЛП» начался в начале 70-х годов XX века в городе Санта-Круз штата Калифорния. Его основатели – психолог Ричард Бэндлер и лингвист Джон Гриндер — люди, которые хотели изменяться и помогать в этом окружающим.
На основе этих разработок были созданы базовые программы – курсы НЛП-Практик и НЛП-Мастер.
Целями и задачами курса НЛП-Практик являются знакомство с основами и освоение базовых методик нейролингвистического программирования, овладение навыками и техниками успеха и радости, получение личного опыта достижения результатов.
Целями курса НЛП-Мастер являются более глубокая проработка себя и своей жизни, осознание своего Предназначения и погружение в духовные традиции мира, овладение инструментами моделирования успешных стратегий и создания новых навыков и новых изменений.

Но как именно НЛП обучение помогает людям?
Ответ на вопрос «Зачем нужно НЛП лично вам?» знаете только вы сами. Но вот лишь меньшая часть того, что вам способно предложить нейролингвистическое программирование:
умение управлять своими эмоциями;
умение осознанно влиять на людей, убеждать их, навык переговоров;
навык быстрой адаптации к новому окружению или условиям;
умение моделировать и быстро осваивать любые навыки;
способность быстро восстанавливать энергию;
умение понимать истинные намерения людей и противостоять гипнотической речи;
работа с убеждениями и умение находить среди них ограничивающие;
умение менять состояние (на уверенное, сконцентрированное, спокойное и т.д.).
И многое другое, актуальное или неочевидное, что может пригодиться в самый неожиданный момент.

Моделирование в НЛП
Отдельно стоит поговорить о моделировании в НЛП. Дело в том, что все люди не прочь обзавестись парой-тройкой полезных умений и способностей, которые гарантированно облегчат им жизнь и дорогу к самореализации. Вопрос лишь в том, сколько времени придется потратить на освоение того или иного навыка.
Современность диктует свое условие: чем выше скорость, тем лучше результат. Теперь отдавать 3-5 лет своей жизни за обладание тем или иным навыком не иначе, как преступное расточительство.
Конечно же, речь не идёт об объективно трудных умениях, которые составляют базу профессий вроде инженера, биотехнолога или врача. Речь идет скорее о чисто человеческих навыках, которые являются как бы дополнительными, но при этом определяющими успех в любой сфере деятельности (например такие умения как видеть тренды; оказывать влияние на людей, убеждать; легко заводить знакомства; быстро обучаться языкам; концентрироваться и т.п).
Причём же здесь НЛП, спросите вы? В том-то и дело, что буквально при всём. НЛП обучение сочетает в себе самые эффективные практические (что крайне важно) знания из всех областей современной психологии и, благодаря этому, успешно занимается моделированием человеческих навыков и качеств.
Люди совершенно точно делятся на три категории по отношению к НЛП:
Те, кто никогда ничего не слышал про НЛП;
Те, кто в нем совершенно не разбирается и, наслушавшись басней от таких же не разбирающихся, критикует и обесценивает;
Те, кто начал и продолжил разбираться и поэтому уважает, использует и, конечно же, живет все лучше и лучше.
Все, кто, так или иначе, соприкасается с системой знаний под названием НЛП и занимаются её изучением, совсем скоро видят, что в нейролингвистическом программировании есть доступ к феноменальной системе изменения человеческого бытия.
Что же такое НЛП моделирование простыми словами?
Представьте, что у вас есть некий знакомый (пусть даже не знакомый с вами лично), обладающий какими-то очень крутыми, ресурсными способностями. Это может быть что угодно: от умения эффектно выступать перед аудиторией до способности дисциплинировать себя. И вам, естественно, тоже хочется научиться этому же. Но как именно это сделать, чтобы «вписать» в себя эти навыки, вы пока не знаете.
А хочется!
Именно этим (а не манипулятивными хитростями и обманом, как принято считать) на самом деле и занимается НЛП в апогее своих возможностей: сначала раскладывает нужную способность на элементы, а потом собирает её по-новому, адаптируя её под вас.
По сути, так работает любая система обучения. Именно так вы и учитесь танцевать, рисовать, играть на инструменте. Сначала для вас «разложили» танец на целую последовательность мелких элементов, создали «подготовительное поле», а потом вы из этих элементов собираете в себе этот танец и раскрываетесь совершенно по-новому и для себя и до мира. Разница только в том, что НЛП моделирование даёт возможность обучиться многим крутым способностям в очень короткие сроки.
Ну что, хочется попробовать?
*Наша бесплатная энциклопедия нейролингвистического программирования: НЛП Wiki

UPD: Мы все таки это сделали — видеокурс НЛП Практик увидел свет!
Это подробный видео учебник с упражнениями, пояснениями и практическими кейсами с доступом к знаниям в любой точке мира и в любое время.
Полный видеокурс НЛП Практик Базовый состоит из восьми частей, каждая из которых представляет из себя самостоятельный видео учебник по отдельным темам нейролингвистического программирования. Несмотря на то, что все восемь частей логически выстроены в последовательный курс, вы сможете начать самостоятельное обучение с любой из частей, которая содержит нужные вам темы.
Слушайте. Повторяйте. Практикуйте. Внедряйте. Меняйте отношение к жизни и ситуациям на более конструктивное. Учитесь по-новому общаться с собой, с другими, с миром.
Новые мысли и знания приведут к вашему новому поведению и новым реакциям. А это, в свою очередь, быстро притянет в вашу жизнь новые классные результаты во всех сферах.
Подробнее о курсе читайте здесь.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter (на Mac тоже Ctrl+Enter). Спасибо!
Закладка0
«Что такое нлп? Насколько это полезно ? Расскажите по-подробней ?» – Яндекс.Кью
Если предположить, что Лучшее враг Хорошего, то в социальном аспекте
НЛП устраняет противоречия и конфликты у тех, кто не понимает и/или не
любит гениев, хотя вынужден идти на поводу их Величайших Открытий
навстречу Прогрессу
Вот давайте представим на несколько минут…. Кем бы я был, если бы не знал ничего о нейро-лингвистическом программировании. Моя жизнь состояла бы… была полна мелких и не нужных переживаний, малоприятных чувств. Я был бы полон страха за себя и за тех, кто рядом со мной. Мелочился, спорил по пустякам, подгребал бы под себя по-мещански, не понимал искусства, был подозрителен, циничен и возможно бы курил, пил и ругался, завидовал счастливчикам, и шел на пролом, обвиняя других или себя в неудачах.
Я бы не мог адекватно, т.е. в меру и уверенно, доверять людям (потому что бы ошибался в людях и не замечал когда мне врут, когда искренне заблуждаются, а когда «истерят», т.е. выдают желаемое за действительное (сейчас это очень популярно не только в СМИ). Т.е. в первую очередь, я бы меньше замечал действительность и больше бы заблуждался в себе и окружающих, в том числе и моих родителях. Хотя мне с ними и повезло.
Естественно, все это привело к тому, что я бы не приобрел особенное качество жизни. Нет, это не богатство и комфорт, а великолепное понимание того, что возможно всё. Например. Статью написать? Да. Весело ответить на вопросы? Пожалуйста. Построить перспективные отношения или выйти из безвыходного положения достойно и смело? Чудесно. И т.д. И т.п. Это был бы не просто оптимизм. А уверенный путь.
Я бы не мог быстро схватывать и развивать идеи, которые подкидывает мне жизнь. Идти точно к своим целям. Строить свои проекты. Я уже не говорю о том, что я бы мог ввязаться в плохие компании и потерять себя. Т.е. вместо достижений и раскрытия своего потенциала мне бы пришлось играть по чужим правилам и наступать на грабли без надежды исправить ситуацию. Возможно, я бы хорошо играл в шахматы и домино. Или танцевал. Согласен. На НЛП белый свет клином не сошелся. Я рад, что со школы увлекался психологией, фантастикой, единоборствами. Но мне не пришлось бы выбирать из большего. Но я бы меньше понимал то, как устроен мир человеческих отношений. И не мог бы себя уверенно развивать.
Конечно. Я отлично разбираюсь в НЛП. Еще бы. Уже 26 лет его практикую. И нет добра без худа. Я могу ввязаться в дела, которые другим не под силу. Или меня могут не понимать другие, просто не привыкшие к темпу моей жизни. Но тут надо уже говорить о общечеловеческих правах, нравственности и морали. И я рад, что на планете есть люди, которые много достигли и без НЛП. И я могу с ними поговорить. И вот почему. Потому что мы друг друга очень хорошо понимаем.
А про нлп обучение… Хотите абсолютно бесплатный урок нлп по творчеству из курса нлп практик? Вот. Сделано для Вас: http://нлп.space/stryd/
P.S. И последнее. Это моё мнение. Мне повезло учиться у самих основателей НЛП. Джона Гриндера, Джудит Делозиер, Энн Энтус, Роберта Дилтса, Ричарда Бендлера, Мерлин Аткинсон, Джефри Зайга, Питера Врицы, Яна Ардуя, Браина Вандерхорста. А не у той гопоты, которая и образования психологического не имеет. Но называет себя ТренерАми 🙂 Я не ошибся с выбором учителей. И Вам того же желаю, друзья.
Эх.. тут бы еще мой ролик разместить. Он мне очень нравится… Сделано с помощью НЛП. Фотографии и текст мои. А музыка по лицензии. Можете посмотреть это короткое видео. На рекламу не обращайте внимание. Попробуйте сделать такую же 🙂 Получится? Маленький результат от нлп.
www.youtube.com/embed/_XVLqcSDLOY?wmode=opaque
Статья НЛП — это про что?
Спросите практически любого не НЛПера (то есть человека, не считающего себя НЛПером, хотя, возможно, и владеющего НЛП) или кого-то, кто просто что-то слышал или читал об НЛП «Что такое НЛП?», и вам однозначно скажут: НЛП — это манипуляция! Спросите практически любого НЛП-практика (то есть человека, считающего себя НЛПером, хотя, возможно, и не практикующего НЛП) — «Что такое НЛП», и он вам скорее всего скажет, что «НЛП — это набор инструментов». И если вы спросите его, для чего нужны эти инструменты, то скорее всего услышите, что «Для эффективной коммуникации» или «быстрого создания изменений». Еще пара метамодельных* вопросов, и вы узнаете, что «эффективная коммуникация» — это манипуляция, а «создание изменений» — это психотерапия. 🙂 Ну а чего вы ожидали увидеть за таким названием — «нейро-лингвистичское программирование»? 🙂 Сейчас создатели НЛП, конечно, раскаиваются по поводу такого названия, но, вообще-то, изначально они и не рассматривали НЛП, как массовый коммерческий продукт.
Так про что же тогда НЛП? Совершенно точно не про манипуляцию и не про психотерапию. Хотя, некоторые приемы, модели и техники НЛП позволяют довольно успешно делать и то и другое. Но на самом деле (цитирую Гриндера**) «НЛП — суть моделирование мастерства. Это объяснение и кодификация моделей поведения мастерства, которые предполагают различие между действием обыкновенным и гениальным.»То есть, (цитирую Пьюселика**) «НЛП — это наука о совершенстве».
Но вы можете встретить применяющиеся паттерны*** НЛП в коучинге, психотерапии и консалтинге, в техниках продаж и переговоров, в методиках изучения иностранных языков, в рекламе и маркетинге, в подборе и оценке персонала… да и, наверно, много где еще. Почему так получилось?
Потому что моделируя гениальность и используя для этого нейролингвистику, НЛП собрало в себе «золотую коллекцию» моделей, описывающих, как работает мышление человека, и позволяющих в некоторой степени управлять этим процессом. А значит в любой профессиональной деятельности, которая связана с мышлением человека, с успехом может быть использовано НЛП. Что мы и видим. …Ну и, конечно же, никто вам никогда не скажет об этом — либо потому что сам не знает, либо скорее всего, чтоб вы не подумали про него ничего дурного. Ведь «НЛП — это манипуляция!» 😉
О том же, как возникло НЛП, очень хорошо рассказывают сами его основатели — Джон Гриндер и Фрэнк Пьюселик в своем интервью.
P.S. Спустя 10 лет после создания НЛП (в 80-х) Джон Гриндер создает Новый Код НЛП. Одна из основных целей Нового Кода НЛП — дать людям паттерны, позволяющие самостоятельно работать с собственными задачами, а один из его ключевых аспектов — более широкие возможности для работы с бессознательным, позволяющие получать информацию из его глубин, бессознательно анализировать ее (то, что называется интуиция), и поручать ему выполнение задач в «фоновом режиме», то есть без сознательного контроля.
— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —
* Мета-модель — модель НЛП, позволяющая собирать инфомацию, которая не высказывается или вовсе не осознается собеседником.
** Джон Гриндер, Фрэнк Пьюселик и (не упоминаемый здесь) Ричард Бэндлер — основатели НЛП.
*** Паттерн — здесь: точно исполняемый навык, определенный алгоритм действий.
Что такое техника НЛП, или как запрограммировать себя на успех | Путешествия
Сегодня модно заниматься саморазвитием. И техника НЛП — это метод, который предполагает, что если один человек стал успешным, то и вы тоже можете повторить его успех. Для этого лишь нужно правильно себя запрограммировать, разобраться с методами обработки информации и…скопировать поведение того самого удачливого человека!

Unsplash
НЛП — это…
Под этой аббревиатурой скрывается психологический подход, который называется Нейролингвистическое программирование. Он сочетает в себе набор техник, которые помогают связывать мысли, язык и модели поведения с конкретными результатами. А зная эти результаты, вы можете провести анализ и применить удачные действия для достижения своих собственных целей.
Сторонники НЛП считают, что все поступки человека полезны. Даже если план не сработал или сработал не так, как вам надо, — это не плохо. Наоборот, этот опыт лишь дал вам больше полезной информации для анализа.
Когда появилась эта техника?
В далеких 70-х годах в Калифорнийском университете благодаря лингвисту Джону Гриндеру и психологу Ричарду Бэндлеру. Их первая совместная книга по НЛП «Структура магии: книга о языке терапии» рассматривала определенные модели общения, которые отличают успешных коммуникаторов от менее успешных. А за основу авторы взяли работы психотерапевтов Вирджинии Сатир, Фрица Перлза и Милтона Эриксона. Результатом работы Гриндера и Бэндлера стала разработка мета-модели НЛП — техники, которая позволяет выявить языковые паттерны, отражающие основные когнитивные процессы.
Как работает НЛП?
Unsplash
Основным методом работы НЛП считается копирование поведения успешных людей. Если вы сможете понять, как кто-то другой выполняет задачу, то этот процесс можно скопировать и перенести на себя. Чтобы вы тоже могли выполнить ту же самую задачу. Но здесь очень важен опыт. Поэтому, если человек хочет понять какое-то действие, он должен совершить его сам, чтобы извлечь уроки из полученного опыта.
Изучая, как наш мозг обрабатывает информацию, техники НЛП помогают нам взглянуть на мысли, чувства и эмоции как на вещи, которые мы можем контролировать. А не как на то, что пассивно происходит с нами. Поэтому еще одной из особенностей НЛП является идея о том, что человек предвзято относится к какой-то сенсорной системе. Известной, как предпочитаемая репрезентативная система или PRS.
Что это значит? А то, что у каждого человека есть предпочтительный метод обработки информации. Его легко может отследить специалист по НЛП. Например, если вы говорите «Я вижу вашу точку зрения», то это может указывать на визуальную PRS. А если «Я слышу точку зрения» — то на аудиальную. Практика НЛП же должна помочь научиться чередовать все техники обработки информации. Потому что считается, что это поможет достичь большего успеха.
Чем еще полезна практика НЛП?
НЛП также стремится наладить эффективную связь между вашими сознательными и бессознательными психическими процессами. Которые должны помочь повысить творческий потенциал и навыки решения проблем. А еще эта техника помогает бороться с тревогой, фобиями, паникой и даже посттравматическим стрессом. И это далеко не все полезное, что может дать вам Нейролингвистическое программирование.
Действительно ли практика помогает достигать успеха?
Так как техника звучит сложно, но многообещающе, то становится интересно, правда ли она работает с научной точки зрения. На этот вопрос ответить сложно. Так как научные исследования о НЛП дали неоднозначные результаты. Например, исследование, опубликованное в журнале Counselling and Psychotherapy Research, показало, что у пациентов, которые применяли НЛП, улучшились психологические симптомы и качество жизни. Но это лишь один из немногих положительных результатов. В обзорной статье 2010 года была предпринята попытка оценить результаты исследований, связанных с теориями, лежащими в основе НЛП. И из 33 исследований лишь 18% подтвердили успешность основных практик.
Что такое техника НЛП, или как запрограммировать себя на успех was last modified: 21 сентября, 2021 by Дарья Рудакова
ОБ НЛП
Термин «нейролингвистическое программирование» (НЛП) произошёл от названия трёх наук, соединённых вместе:
* Нейрология — изучает разум и то, как человек мыслит.
* Лингвистика — исследует то, как человек использует язык и какое влияние оказывает язык на его личность.
* Программирование — то, как мы строим наши действия, чтобы добиться желаемой цели.
Джудит Делозье
«Если бы я давала имя НЛП, я бы расшифровала его как Now Let’s Play, что означает «Теперь давайте поиграем». Это о том, как научиться делать серьезные вещи изящно, эффектно и с удовольствием».
Дж. О’Коннор, Дж. Сеймор
«В практическом аспекте НЛП — это искусство и наука о личном мастерстве. Это практическое руководство, позволяющее добиться тех результатов, к которым мы стремимся в этом мире. Это описание того, что создаёт различия между выдающимся и обычным».
Роберт Дилтс
«Приемы и методы НЛП являются эффективными средствами создания лучшего будущего для нас, наших семей и коллег. Среди областей применения НЛП можно выделить такие, как достижение личных целей, решение семейных проблем, помощь в обучении и развитии творческого мышления, поддержание физического и психического здоровья, улучшение дел в бизнесе.
Моделирование может трансформировать наше восприятие других людей. Например, если мы видим человека, делающего что-то лучше нас, то вместо того, чтобы испытывать чувство неполноценности, завидовать и проявлять подозрительность, мы можем моделировать его деятельность».
Ричард Бендлер
«Хотя куча психологов и социальных работников используют НЛП, чтобы делать то, что они называют «терапией», я считаю более правильным описывать НЛП как образовательный процесс. По сути, мы разрабатываем способы научить людей пользоваться собственными мозгами».
Нейролингвистическое программирование сегодня — это изучение духовного и целительского опыта различных культур для перенесения его в повседневную жизнь, системный анализ и синергетика бизнеса и семейной жизни, исследования убеждений и верований, определяющих наши решения и ограничения.
Рене Декарт
«Недостаточно иметь хороший ум. Главное — правильно его использовать».
Психотерапевтическая энциклопедия об НЛП
НЛП — модель человеческих коммуникаций и поведения, которая может быть эффективно использована для организации и описания взаимодействий в психотерапии, педагогике, менеджменте с целью их оптимизации; современное направление постэриксоновской психотерапии. НЛП базируется на ряде источников:
* На изучении и анализе практики Эриксона (см. Милтон Эриксон), Сатир, Перлса и других представителей американской психотерапии;
* На современных данных о межполушарной асимметрии — различиях в переработке информации правым и левым полушариями; работах Бейтсона, посвящённых «экологии разума»;
* На трансформационной грамматике Хомского, выделяющей глубинные структуры языка, правила организации и трансформации сообщения;
* На исследованиях кибернетики 50-60 гг., стирающих границы между искусственным и естественным интеллектом; на теории логических типов Рассела.
***
НЛП (нейролингвистическое программирование), NLP — это одновременно и наука, и искусство. Наука — потому что имеет четкую структуру и хорошую аксиоматическую базу. В этом качестве НЛП предлагает сбалансированный системный подход к разрешению любых ситуаций. Искусство — ибо опираясь на строгий фундамент уже выявленных структур успеха, мы можем творить в свободном поиске своего собственного совершенства. НЛП предоставляет форму, а мы вольны самостоятельно выбирать наполнители.
НЛП (NLP) изучает таланты и способности — именно то, с помощью чего выдающиеся личности и организации достигли потрясающих результатов. Эти методы можете усвоить и вы, чтобы добиться не меньшего. Этот процесс называется моделированием.
НЛП (NLP) не ограничивается только рамками поведения. Оно затрагивает и способ мышления, от которого зависят все наши достижения в целом. Моделируя мыслительный процесс, возникновение и развитие чувств и убеждений, НЛП рассматривает все составляющие человеческого опыта. Но, прежде всего, НЛП занимается процессами общения — общения человека с самим собой и с другими людьми.
НЛП (NLP) — это ваш жизненный опыт, то, как вы познаёте мир, как решаете, что делать, как создаёте собственную реальность со всеми её подъёмами и спадами.
За годы своего развития НЛП накопило огромное количество выверенных инструментов, позволяющих сделать наши жизни легче и проще. Они работают эффективно и эффектно, но самое главное — они работают! Пользуясь НЛП, люди добивались реализации в той области, которая была для них важна: личных и профессиональных отношениях, карьерном и личностном росте, саморазвитии… Возможно именно благодаря тому, что в руках самых разных людей они продолжают работать, НЛП и получило такое значительное распространение по всему миру. Обзор группы
| НЛПИ
Основная деятельность NLPI в проектах, связанных с инфраструктурой, была сосредоточена в транспортном секторе, посредством чего она инвестировала сотни миллионов долларов в строительство, реконструкцию и маркетинг 2037-километрового железнодорожного коридора, простирающегося из Южной Африки вдоль Зимбабве и Замбии, и до Демократической Республики Конго («Коридор»).
Коридор является основным узлом для полезных ископаемых, идущих на юг, в основном меди и медных концентратов, доставленных из богатых полезными ископаемыми стран вдоль известного региона Медного пояса в Южную Африку, а также готовой продукции и материалов для добычи полезных ископаемых, идущих на север.Это самая важная железнодорожная ветка, соединяющая страны-члены Сообщества по координации развития юга Африки (SADCC) с региональными портами. Он служит спасательным кругом для региональной экономики.
The Corridor, объединенный под управлением NLPI, создает уникальную возможность для эффективной работы железных дорог с бесперебойным обслуживанием обширных региональных, национальных и международных рынков.
«Коридор» был создан в результате реализации трех железнодорожных проектов, каждый из которых принадлежит и управляется другой дочерней компанией NLPI.
Реализован в Зимбабве на основе BOT компанией Beitbridge-Bulawayo Railway (PVT) Limited (BBR) , 350-километровая железнодорожная линия от Бейтбриджа (пограничный пост между Южной Африкой и Зимбабве) до Булавайо (самый промышленно развитый город Зимбабве) ) построен в рекордно короткие сроки, этап строительства длился всего 18 месяцев.
Подробнее.
Реализованная в Замбии компанией Railway Systems of Zambia Limited (RSZ) , эта железнодорожная линия протянулась почти на 1200 километров и охватывает всю территорию между Саканией (на границе с Демократической Республикой Конго) и водопадом Виктория (на границе с Зимбабве).Он включает в себя район Медного пояса в северной части Замбии и другие железнодорожные ветки
Подробнее.
Завершая весь коридор, третий проект был реализован в Зимбабве компанией NLPI Logistics (NLL) , поставщиком услуг железнодорожной логистики и подвижного состава. NLL приобрела маркетинговые права на «Северную линию», 470-километровый участок между Бейтбриджем (на границе с ЮАР) и водопадом Виктория (на границе с Замбией).
Подробнее.
Акционеры NLPI участвуют в еще одной крупной инвестиции в New Limpopo Bridge (Private) Limited (NLB) , которая в соответствии с концессионным соглашением BOT построила и в настоящее время эксплуатирует платный мост через реку Лимпопо между пограничными постами в Мессине на юге. Африка и Бейтбридж в Зимбабве.
Подробнее.
После подписания новых соглашений NLPI в настоящее время занимается продвижением других крупномасштабных предприятий, занимающихся строительством, эксплуатацией и сбытом двух электростанций в Зимбабве (всего 1700 МВт). Кроме того, NLPI недавно разработала несколько сегментов торговли сырьевыми товарами, сосредоточив внимание на продуктах, которые обеспечивают добавленную стоимость для всех членов Группы.
В Группе напрямую работает 1 500 человек, а еще 2 000 человек работают косвенно.Он имеет один из крупнейших частных парков подвижного состава в Африке, состоящий из 4600 вагонов разных типов и более 80 локомотивов. У Группы также есть современные мастерские и другие объекты площадью 10 000 квадратных метров.
Сообщество | НЛПИ
Иногда бизнес-организации дистанцируются от сообщества, в котором они работают. В НЛПИ все не так. Основываясь на наших деловых достижениях и понимании хороших отношений с общественностью, NLPI играет и будет продолжать играть важную роль в служении и поддержке местного сообщества.Вот некоторые основные моменты общественной работы NLPI.
Развитие района Бейтбридж
Несколько лет назад NLPI приняла решение ежегодно вносить вклад в рост и развитие всего района Бейтбридж. Значительная часть годовой прибыли компании возвращается обществу в виде денежных пожертвований для использования в проектах развития капитальной инфраструктуры.
Поддержка обездоленных
NLPI стала лидером программы World Vision Zimbabwe по поддержке детей из бедных семей в сельской провинции Южный Матебелеленд.Программа оплачивает школьные сборы, предоставляет форму и покупает книги и школьные принадлежности для детей из малообеспеченных семей. В настоящее время НЛПИ спонсирует более 10 детей в этой программе.
Оказание медицинской помощи и раздача детских домов
Посвященный оказанию помощи местному сообществу, NLPI предоставил средства, медицинское оборудование, продукты питания и мебель для больниц, медицинских центров и детских домов. NLPI много работал над улучшением качества медицинских услуг, доступных любому гражданину.Компания учредила Целевой фонд New Limpopo Bridge для оказания помощи детскому отделению больницы Бейтбриджа и всему сообществу Бейтбриджа. За последние несколько лет NLPI сделала пожертвования детям-сиротам из общины Хванге, приюта Маранге, детскому дому Касиси, дому Джозефа и детской деревне Кайелихле.
С 2001 года NLPI оказывает постоянную поддержку восьми детям-инвалидам из центров ассоциации Джайроса Джири в Хараре и Булавайо. NLPI оплатила расходы на школу и интернат; пожертвовали костыли, ходунки и инвалидные коляски.NLPI помогает людям с ограниченными физическими возможностями на индивидуальной основе. Они оказывают полную поддержку в обучении и покупают компьютеры для работы и технического обучения.
Образование — особая причина НЛПИ. Компания регулярно раздает деньги школам по всей Зимбабве, особенно в сельской местности. В июле 2005 года компьютеры и принтеры были розданы трем средним школам (Тшидиксва, Нули и Зезани) в районе Бейтбриджа. Школа Топохо и многие другие школы вокруг Бейтбриджа получили в дар столь необходимые учебники.
NLPI оказал помощь в строительстве, обновлении и оснащении этих (и других) школ в Замбии: средней базовой школы Чеве, начальной школы Чивалы, средней школы Кабве, базовой школы Малима, базовой школы Муйембе, начальной школы Нчаанги, базовой школы Нченаме. Он также профинансировал ряд значительных строительных и инфраструктурных проектов:
Библиотечный корпус средней школы Бунгве в Филабуси.
Электроэнергия для средней школы Мквабене в Авока, средней школы Донаин в Кадоме и школы Зедза в районе Маранге в Мутаре.
Реконструкция разрушенного класса начальной школы Мтенгве в Бейтбридже. (Школа была официально принята NLPI и переименована в начальную школу BBR Mtetengwe в честь одной из дочерних компаний NLPI.) NLPI гарантирует ежегодную поддержку для обеспечения дальнейшего развития школы и улучшения учебных заведений. Начиная с 2007 года, NLPI предоставит каждому из 450 учеников два комплекта формы.
«Хорошая игра»
Спорт пробуждает чувство гордости на местном и национальном уровне и способствует активному участию общества.
Прочные связи NLPI со знаменитым клубом «Арсенал» помогают привить школьникам всей Африки дух товарищества в спорте. NLPI и Arsenal жертвуют такие предметы, как футбольные мячи, детям из малообеспеченных семей, школам и центрам отдыха по всей Африке.
NLPI является основным спонсором футбольного клуба Beitbridge и поддерживает футбольный клуб Railstars в Булавайо и футбольный клуб Unicem в районе Гванда.
Сборная Замбии по футболу «Кабве Уорриорз» спонсируется НЛПИ.Денежное пожертвование способствовало участию команды в играх Кубка африканских наций 2005 года в Египте.
НЛПИ вносит другие взносы, связанные со спортом:
Он является одним из спонсоров ежегодного открытого турнира по гольфу Hwange Open Golf Tournament для профессиональных и любительских игроков в гольф. Он также спонсирует ряд других любительских и благотворительных турниров по гольфу.
NLPI спонсирует и поддерживает деятельность национальной сборной Замбии по регби через Футбольный союз Замбии по регби.
Hwange Netball Club, местная команда, получила денежное пожертвование на покупку нового оборудования для сезона нетбола 2006 года.
На протяжении многих лет NLPI жертвовала собственность и недвижимость муниципалитетам и местным советам для использования в качестве жилых домов, складов и надомных хозяйств, принося столь необходимые доходы.
NLPI пожертвовала свой жилой комплекс Mazunga Сельскому совету округа Бейтбридж для использования в качестве центра рыболовных проектов и приюта.
В районе Гванда NLPI передала в дар муниципалитету свой жилой комплекс.
Жилые дома NLPI в Коллин Баун, Антениор и Стэнмор были переданы в дар местным советам.
Быть там во время бедствий
На протяжении многих лет NLPI оказывала значительную финансовую и гуманитарную помощь и помощь после разрушительных стихийных бедствий (циклон Элин на юге и востоке Зимбабве и извержение вулкана в Демократической Республике Конго).
RSZ Стремясь к благосостоянию и развитию общества, компания тратит более 1 миллиарда кений на различные проекты по всей стране
Железнодорожные системы Замбии инвестировали более 1 миллиарда кений в различные проекты, направленные на повышение благосостояния сообществ, в которых она работает.Компания, которая в декабре 2003 года взяла на себя управление компанией Zambia Railways Limited, реализовывала различные проекты общественного развития только вдоль железнодорожной линии.
RSZ стремится к благосостоянию и развитию общества
Компания тратит более 1 млрд. Кений на различные проекты по всей стране.
Железнодорожные системы Замбии инвестировали более 1 млрд. Кений в различные проекты, направленные на повышение благосостояния сообществ, в которых она работает.Компания, которая в декабре 2003 года взяла на себя управление компанией Zambia Railways Limited, реализовывала различные проекты общественного развития только вдоль железнодорожной линии.
За последние четыре года, несмотря на необходимость выделения ресурсов на восстановление железнодорожной линии, локомотивов и пассажирских вагонов, компания активно участвовала в национальных программах и мероприятиях, взяв на себя поддержку общественных проектов и инициатив, включая образование, молодежь. благосостояние, культура и спорт.
Железнодорожные системы Замбии имеют давнюю приверженность сообществу, в котором они работают, и с тех пор расширили эту поддержку по всей стране. Компания ежегодно выделяет средства на общественные проекты, и с тех пор она потратила около 1 426 546 353,21 кенийских крон с момента начала своей деятельности.
Это обязательство перед обществом продолжается и в 2008 году, поскольку компания рассчитывает потратить на различные виды деятельности больше, чем было потрачено в предыдущем году, и подтвердить свою роль как ответственного корпоративного социального гражданина.
В соответствии с Президентской инициативой «Сохранение Замбии чистой и здоровой» 15 декабря 2007 года RSZ в партнерстве с муниципальным советом Кабве возобновил программу в комплексе Макулулу, где уважаемый заместитель министра местного самоуправления и жилищного строительства д-р Э. Казонга — депутат, исполняющий обязанности; в сопровождении местного депутата парламента достопочтенной Глэдис Ньиронго. RSZ внесла свой вклад в программу перезапуска, пожертвовав различные материалы и выбрав стратегический круговой перекресток в центре города для благоустройства и обслуживания.Кроме того, в первом квартале 2008 года RSZ официально запустит свою собственную программу «Сохраняйте Замбию чистой и здоровой» в Кабве и в основных городах вдоль железнодорожной линии, где она работает. Посредством этой программы RSZ намеревается охватить сообщества и внести свой вклад в создание здоровой окружающей среды там, где она предлагает свои железнодорожные услуги.
«Вскоре мы запускаем кампанию« Сохраним Замбию чистой и здоровой »вдоль железнодорожной линии, и это будет происходить в сотрудничестве со всеми местными советами.С помощью этой программы мы надеемся охватить общины и помочь им там, где это необходимо, что уже продемонстрировано нашим пожертвованием на повторный запуск проекта «Сохраним чистоту и здоровье Кабве в Замбии», — говорит г-н Чарльз Фири, исполнительный менеджер по корпоративным вопросам RSZ.
Демонстрируя свою приверженность соблюдению нормативных требований в отрасли, компания с момента приобретения железных дорог соблюдала все экологические требования в регионах своей деятельности.
RSZ уделяет приоритетное внимание сокращенным железнодорожным служащим и поддерживает их посредством контрактов в различных областях, чтобы смягчить последствия безработицы.Эта поддержка улучшила жизнь этих бывших сотрудников.
RSZ активно участвует в общественной жизни на всех фронтах, поддерживая самые разные дела по всей стране. Компания приняла детские дома Children of Promise и Arteco в Кабве. Два детских дома финансируются ежегодно в размере 54 000 000 и 36 000 000 кений соответственно. Эти средства идут на различные нужды детей-сирот, проживающих в этих центрах.
В недавнем прошлом компания также оказывала поддержку другим детским домам, включая детский дом Касиси, Africa Hope, Open Arms Family, Mother of Mercy и поддержку общественной инициативы Морин Мванаваса.
RSZ поддерживает не только малоимущие сообщества. Футбольный клуб Kabwe Warriors остается одним из спонсоров, причем RSZ и Zambia Railways Limited поддерживают высшую летную команду, выделяя по 250 миллионов корейских крон каждый в год. Спонсирование футбольного клуба соответствует видению RSZ в отношении развития спорта. RSZ поддерживает ежегодное финансирование команды FAZ Super League с 2003 года.
«Мы также оказали поддержку Футбольной ассоциации регби Замбии и юным игрокам в гольф Замбии.RSZ также спонсирует участие работников в общественных или межфирменных мероприятиях, таких как социальный футбол, чтобы сотрудники оставались активными », — добавляет г-н Фири.
В соответствии с политикой компании, направленной на поддержку традиционных ценностей страны, RSZ внесла свой вклад в проведение церемоний, в том числе Куомбока у Лози и Куламба Кубвало у Лендже.
Railway Systems of Zambia является ключевым партнером правительства, активно участвуя и финансируя большинство национальных программ, таких как поддержка празднования Дня труда и Дня независимости в его штаб-квартире в Кабве.
Компания была и будет поддерживать сообщество. RSZ был в авангарде празднований, таких как празднование 100-летия города Кабве, и остается приверженным дальнейшему развитию города.
В 2008 году RSZ будет играть активную роль в качестве ответственного корпоративного гражданина. Расширенное партнерство RSZ с правительством и его заинтересованными сторонами в его усилиях по возвращению обществу останется не только в городах вдоль железнодорожной линии, но и по всей стране, где ее неизменная корпоративная поддержка будет иметь наибольшее значение.
Участие NlpI в способности NMEC выживать в сыворотке человека ….
Контекст 1
… хроматография с Ni-заряженной колонкой, как описано ранее (41). Очищенный рекомбинантный белок использовали для повышения уровня кроличьей антисыворотки к NlpI, следуя процедурам, описанным ранее (34). Антисыворотка была способна распознавать рекомбинантный белок, а также обнаруживать NlpI в RS218 дикого типа, но не в его мутанте nlpI (см.рис.S2 в дополнительном …
Контекст 2
… клетки были значительно убиты в NHS, в соответствии с анализом окрашивания LIVE / DEAD бактерий после инкубации с NHS [см. Рис. S3 в дополнительном мате- риал]). Мутант продемонстрировал значительно более низкую способность выживать в NHS, чем штамм дикого типа, но штаммы дикого типа и мутантные штаммы показали сходные показатели выживаемости в HI-NHS (рис. 2A). Кроме того, в NHS RS218 nlpI, транскомплемированный плазмидой pNI1, показал значительно более высокий уровень выживаемости, чем RS218 nlpI, несущий контрольный вектор pCL1920, и выживаемость RS218 nlpI, дополненного pNI1, была аналогична выживаемости WT RS218, несущей pCL1920 ( Инжир.2Б). Эти данные предполагают, что NlpI, вероятно, будет …
Контекст 3
… и мутантные штаммы показали аналогичные показатели выживаемости в HI-NHS (рис. 2A). Кроме того, в NHS, RS218 nlpI, транскомплемированный плазмидой pNI1, показал значительно более высокий уровень выживаемости, чем RS218 nlpI, несущий контрольный вектор, pCL1920, и выживаемость RS218 nlpI, дополненного pNI1, была аналогична выживаемости WT RS218, несущей pCL1920 ( Рис. 2Б). Эти данные предполагают, что NlpI, вероятно, участвует в уклонении от NMEC в сыворотке, опосредованной комплементом…
Контекст 4
… совпадающий со штаммом L346 дикого типа (мутант RS218 с делецией lacZ), RS218 nlpI по-прежнему демонстрирует более низкую выживаемость в NHS (рис. 2C), что указывает на то, что сосуществование штамма дикого типа не восстанавливает способность RS218 nlpI выживать в NHS. Этот результат предполагает, что RS218 nlpI вряд ли будет дефицитным в производстве или секретировании в NHS бактериального фактора, который необходим для выживания бактерий в …
Контекст 5
… быть термочувствительным в среде LB с низким содержанием соли, но не в среде LB с обычной концентрацией соли (24). RS218 nlpI также показал сходный фенотип роста (данные не показаны). Затем мы обнаружили, что RS218 nlpI демонстрирует выживаемость, аналогичную выживанию RS218 дикого типа в HI-NHS при 41 ° C, что позволяет предположить, что мутант не является термочувствительным в сыворотке крови человека (рис. 2D). Следовательно, высокая температура, возникающая у инфицированного хозяина, может не быть фактором, способствующим дифференциальному уничтожению хозяином nlpI WT RS218 и RS218 в крови…
Context 6
… потенциальное вмешательство бактериального мусора в анализ проточной цитометрии, мы измерили отложение комплемента на бактериях после инкубации в NHS в течение до 60 минут, хотя величина разницы в сыворотке выживаемость между диким типом и мутантом была больше после 120-минутной инкубации в NHS, чем после 60-минутной инкубации (рис. 2А). В соответствии с результатами анализов выживаемости в сыворотке крови, показанными на фиг.2A, уровни отложения C3b и MAC на клетках RS218 nlpI были значительно выше, чем на клетках WT RS218 после 60-минутной инкубации в NHS (рис.3A-D). Эти результаты демонстрируют, что NlpI, вероятно, участвует в уклонении от комплемента NMEC …
Контекст 7
… мы измерили отложение комплемента на бактериях после инкубации в NHS в течение до 60 минут, хотя величина Разница в выживаемости в сыворотке между диким типом и мутантом была больше после 120-минутной инкубации в NHS, чем после 60-минутной инкубации (рис. 2А). В соответствии с результатами анализов выживаемости в сыворотке крови, показанными на рис.2A, уровни отложения C3b и MAC на клетках RS218 nlpI были значительно выше, чем на клетках WT RS218 после 60-минутной инкубации в NHS (фиг. 3A-D). Эти результаты демонстрируют, что NlpI, вероятно, участвует в уклонении от дополнения NMEC …
Контекст 8
… материал). Кроме того, добавление белка NlpI, меченного N-концом His 6, не влияло на выживаемость WT RS218 в NHS (см. Рис. S5 в дополнительном материале). В соответствии с этими выводами мы обнаружили, что предварительная инкубация WT RS218 с инактивированной нагреванием кроличьей антисывороткой NlpI (см. Раздел «Материалы и методы» и рис.S2 в дополнительном материале) не влияли на способность бактерий рекрутировать очищенный белок C4bp (см. Рис. S6 в дополнительном материале). Эти результаты предполагают, что NlpI не может напрямую взаимодействовать с C4bp в NHS, хотя NlpI экспонируется на бактериальном …
NlpI-опосредованная модуляция образования везикул внешней мембраны через динамику пептидогликанов в Escherichia coli Академическая исследовательская статья на тему «Биологические науки»
Микробиология Открыть
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
NlpI-опосредованная модуляция продукции везикул внешней мембраны за счет динамики пептидогликанов в Escherichia coli
Кармен Швеххаймер, Даниэль Л.Родригес и Мета Дж. Куэн
Отделение биохимии, Медицинский центр Университета Дьюка, Дарем, Северная Каролина 27710
Ключевые слова
Эндопептидаза, грамотрицательные бактерии, Lpp, муреин, PBP4, секреция, Spr.
Переписка
Мета Дж. Куен, кафедра биохимии, Медицинский центр Университета Дьюка, Дарем, Северная Каролина 27710. Тел .: 919-684-2545; Факс: 919-6848885; Электронная почта: мета[email protected]
Информация о финансировании
Эта работа была поддержана грантом 5R01GM099471 Национальных институтов здравоохранения (NIH).
Поступила: 22 августа 2014 г .; Доработана: 10 декабря 2014 г .; Принята к печати: 29 января 2015 г.
MicrobiologyOpen 2015; 4 (3): 375-389
DOI: 10.1002 / mbo3.244
Аннотация
Везикулы наружной мембраны (OMV) повсеместно секретируются внешней мембраной (OM) грамотрицательных бактерий.Эти гетерогенные структуры состоят из ОВ, наполненного периплазматическим содержимым из места почкования. Анализируя мутанты, которые обладают фенотипами продукции везикул, мы можем получить представление о механизме почкования OMV в клетках дикого типа, который до сих пор оставался неуловимым. В этом исследовании мы представляем данные, демонстрирующие, что фенотип гипервезикуляции у мутанта с делецией nlpl Escherichia coli коррелирует с изменениями в динамике пептидогликана (PG). Наши данные показывают, что в культурах стационарной фазы мутант nlpl демонстрирует повышенный синтез PG, который зависит от spr, что согласуется с моделью, в которой NlpI контролирует активность эндопептидазы PG Spr.В логарифмической фазе мутация nlpl подавлялась мутацией dacB, что позволяет предположить, что NlpI регулирует пенициллин-связывающий белок 4 (PBP4) во время экспоненциального роста. Данные подтверждают модель, в которой NlpI негативно регулирует активность PBP4 во время логарифмической фазы и активность Spr во время стационарной фазы, и что в отсутствие NlpI клетка выживает за счет увеличения синтеза PG. Кроме того, мутант nlpl демонстрировал значительное уменьшение поперечных связей, стабилизирующих оболочку ковалентной внешней мембраны (OM-PG), что согласуется с его высоким уровнем продукции OMV.Основываясь на этих результатах, мы предполагаем, что один из механизмов, который грамотрицательные бактерии дикого типа могут использовать для модуляции везикуляции, заключается в изменении перекрестного связывания PG-OM посредством локальной модуляции деградации и синтеза PG.
Введение
Все грамотрицательные бактерии, изученные на сегодняшний день, повсеместно секретируют везикулы внешней мембраны (OMV), которые представляют собой сферические гетерогенные структуры размером порядка 50–250 нм, исходящие из внешней мембраны (OM), содержащей внешнюю оболочку OM и содержимое периплазматического просвета из места расположения бутонизация (Beveridge 1999; Kulp and Kuehn 2010; Deatherage and Cookson 2012; Berleman, Auer 2013; Schwechheimer et al.2013). OMV выполняют многочисленные функциональные роли, опосредуя взаимодействия грамотрицательных бактерий с окружающей их средой (Schooling и Beveridge 2006; Yonezawa et al. 2009; Ellis and Kuehn 2010; Deatherage and Cookson 2012; MacDonald and Kuehn 2013a). Их функции были выяснены в первую очередь в областях взаимодействия хозяин-патоген и
многовидовых сред, таких как биопленки, но они также приносят пользу отдельным бактериям в качестве реакции на стресс, защищая исходную клетку от вредных внутренних или внешних агентов (McBroom and Kuehn 2007; Tashiro et al.2009; Manning and Kuehn 2011; Maredia et al. 2012; McMa-hon et al. 2012; Макдональд и Куэн, 2013b; Schwechheimer and Kuehn 2013).
Внутри периплазматического пространства, зажатого между цитоплазматической мембраной и OM, пептидогликан (PG или murein) образует сетчатую структуру, состоящую из гликановых цепей, поперечно связанных короткими пептидами (Silhavy et al. 2010). PG инкапсулирует гипертоническую цитоплазму и защищает грамотрицательные клетки от лизиса из-за осмотических изменений и механического стресса (Vollmer and Bertsche 2008).Для стабильности оболочки PG ковалентно сшивается с OM через короткий липопротеин
, заякоренный в OM.
© 2015 Авторы. MicrobiologyOpen, опубликованный John Wiley & Sons Ltd.
Это статья в открытом доступе в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы.
Lpp (Браун и Рен, 1969; Браун и Вольф, 1975).Делеция lpp приводит к хрупкой структуре оболочки, связанной с отслаиванием мембран и утечкой клеток (Braun and Wolff 1975; Cascales et al. 2002; Deatherage et al. 2009).
Мы предполагаем, что путем анализа мутантов с фенотипами везикуляции OM, которые не нарушают целостность мембран, мы можем начать выяснять механистические основы продукции OMV. Ранее наша лаборатория провела скрининг и идентифицировала многочисленные вставки транспозонов с измененными фенотипами везикуляции у Escherichia coli (McBroom et al.2006 г.). Один особенно сильный гипервезикулирующий мутант содержал вставку в начале гена nlpl. Кодируемый nlpl генный продукт, NlpI, представляет собой заякоренный в OM липопротеин, который связан с делением клеток, но его точная функция еще не определена (Ohara et al. 1999; Pierce et al. 2011). Примечательно, что мутация в nlpl подавляет температурную чувствительность, связанную с мутацией в spr, кодирующей DD-эндопептидазу муреина (Tadokoro et al. 2004; Singh et al.2012). Spr, скорее всего, также является липопротеином OM на основе структуры последовательности, хотя его липидирование не было экспериментально продемонстрировано (Uniprot 2015).
Фенотипический скрининг также выявил мутанты с дефектами гиповезикуляции. Отдельные делеции nlpA, dsbA и bolA продуцируют меньше OMV, чем дикого типа (WT), и дальнейшие исследования показали, что каждая делеция частично подавляла другой гипервезикулирующий мутант, DdegP (Schw-echheimer and Kuehn 2013). DegP — это периплазматический шаперон и протеаза, которая управляет стрессом неправильно свернутого периплазматического белка (Spiess et al.1999; Райвио и Сильхави 2001; Ортега и др. 2009 г.). У мутанта DdegP неправильно свернутые белки, которые накапливаются, сбрасываются через OMV, и способность этого штамма к гипервезикуляции предотвращает другие негативные эффекты накопления токсичных периплазматических белков на рост бактерий (Schwechheimer and Kuehn 2013). Почему мутации в nlpA, dsbA и bolA снижают уровни везикуляции, еще не понятно: NlpA, DsbA и BolA играют роль в импорте метионина, образовании периплазматических дисульфидных связей и стационарном фазовом переходе, соответственно (Kamitani et al.1992; Bardwell et al. 1993; Zhang et al. 2003; Freire et al. 2009, 2006; Schwechheimer and Kuehn 2013).
В этом исследовании мы стремились получить представление о контроле оболочки производства OMV путем анализа роли nlpl. Мы проанализировали и сравнили продукцию OMV у одиночных мутантов и мутантов, содержащих множественные мутации. Поскольку генетическое взаимодействие nlpl и spr предполагает участие метаболизма PG в фенотипе, мы проанализировали чувствительность штаммов к ингибитору синтеза PG.Кроме того, мы сравнили количество ковалентных поперечных связей Lpp-OM, чтобы установить потенциальный механизм
на основе различий в продукции OMV в штаммах. Вместе эти данные подтверждают модель, в которой NlpI негативно регулирует активность эндопептидазы PG, и что в отсутствие NlpI клетка выживает за счет увеличения синтеза PG. Более того, увеличение динамики PG, предположительно происходящее у мутанта nlpl, коррелирует с наблюдаемым снижением перекрестного связывания Lpp-OM, которое, вероятно, вносит вклад в фенотип гипервезикуляции.
Материалы и методы
Условия роста и реактивы
Штаммы и плазмиды, использованные в этой работе, представлены в таблицах 1 и S2. Бактерии выращивали при 37 ° C в жидкой культуре в бульоне EM Science Luria-Bertani (LB), Miller, pH 7,2 (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) при 25 ° C или на чашках твердого агара LB с добавлением 50 мг. / мл канамицина или 100 мг / мл ампициллина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Изопропил-b-d-1-тиогалактопиранозид (IPTG) (VWR International, Atlanta, GA, USA) добавляли для индукции экспрессии белка, если показано.Мутанты с одним геном происходят из коллекции Кейо (Баба и др., 2006). Для создания мутантов с множественными делециями маркер устойчивости к канамицину был удален из единственного мутанта (Cherepanov and Wackernagel 1995). Затем добавляли дополнительную мутацию путем трансдукции помеченной делеции гена с использованием фага P1 (Silhavy et al. 1984) из единственного мутантного штамма-донора Keio в немаркированный штамм-реципиент-реципиент Keio. Мутанты, сконструированные для этой работы, были либо секвенированы с использованием праймера выше и ниже удаленного гена, либо амплифицированы с помощью ПЦР с праймерами выше / ниже удаленного гена и кассеты канамицина для подтверждения генотипов.
Для получения кривых роста стационарной фазы d-Met культуры (25 мл) инокулировали (разведение 1: 250) и выращивали в течение ночи (~ 16 ч) при 37 ° C. Клетки осаждали на центрифуге Beckman Avanti J-25 (ротор JLA-16.250, 10000 г, 10 мин, 4 ° C), ресуспендировали в свежей среде (25 мл), обработанной указанной концентрацией d-Met или тем же объемом LB (необработанные контроли) и инкубировали (6 ч, 37 ° C) с ежечасными измерениями оптической плотности при 600 нм (OD600).
Конструирование векторов экспрессии
Для экспрессии nlpl и spr под контролем промотора trc были сконструированы pNlpI и pSpr с использованием вектора pTrc99A.nlpl амплифицировали из геномной ДНК с использованием праймеров 5′-GATATCTAGAGCCCTCCGCTGCGGC-3 ‘, содержащих сайт рестрикции XbaI, и 5′-GATTAAGCTTC TATTGCTGGTCCGATTCTGCA-3’, содержащих HindIII
Таблица 1. Штаммы и плазмиды.
Штаммы Генотип Источник / ссылка
Escherichia coll
BW25113 rrnB3 AlacZ4787 hsdR514 A (araBAD) 567A (rhaBAD) 568 rph-1 WT коллекции Keio
Баба и др.(2006)
Коллекция Keio BW251 ’13 с указанными одиночными мутациями: AnlpA :: Kan, Baba et al. (2006)
одиночных мутантов AdegP :: Kan, AdsbA :: Kan, AbolA :: Kan, AnlpI :: Kan, Aspr :: Kan,
Alpp :: Кан, ApbpG :: Кан
MK1277 BW251 ’13 AycfS, AybiS, AerfK :: Кан Швеххаймер
et al. (2013)
MK1280 BW251 ’13 AnlpI, Aspr :: Кан Эта работа
MK1281 BW251 ’13 AnlpI, AnlpA :: Кан Эта работа
MK1282 BW251 ’13 AnlpI, AdsbA :: Kan Эта работа
MK1283 BW251 ’13 AnlpI, AbolA :: Кан Эта работа
MK1284 BW251 ’13 AnlpI, AnlpC :: Кан Эта работа
MK1285 BW251 ’13 AnlpI, AydhO :: Кан Эта работа
MK1286 BW251 ’13 AnlpI, AyafL :: Кан Эта работа
MK1287 BW251 ’13 AnlpI, AyebA :: Kan Эта работа
MK1288 BW251 ’13 Aspr, AdegP :: Kan Эта работа
MK1289 BW251 ’13 AnlpI, Aspr, AdegP :: Kan Эта работа
MK1340 BW251 ’13 AnlpI, ApbpG :: Кан Эта работа
MK1341 BW251 ’13 AnlpI, AmepA :: Кан Эта работа
MK1342 BW251 ’13 AnlpI, AdacB :: Kan Эта работа
MK1263 BW251 ’13 / pTrc99A Schwechheimer
и Куен (2013)
MK1290 BW251 ’13 AnlpI :: Kan / pTrc99A Эта работа
MK1291 BW251 ’13 AnlpI :: Kan / pNlpI Эта работа
MK1292 BW251 ’13 AnlpI, Aspr :: Kan / pTrc99A Эта работа
MK1293 BW251 ’13 AnlpI, Aspr :: Kan / pNlpI Эта работа
MK1294 BW251 ’13 AnlpI, Aspr :: Kan / pSpr Эта работа
MK1296 BW251 ’13 Aspr :: Kan / pTrc99A Эта работа
MK1297 BW251 ’13 Aspr :: Kan / pSpr Эта работа
MK1299 BW251 ’13 Aspr :: Kan / pmSpr Эта работа
Плазмиды
промотор pTrc99A trc, AmpR, pBR322 ori
pNlpI nlpI in pTrc99A, AmpR, IPTG-inducible Эта работа
PSPr spr в pTrc99A, AmpR, IPTG-inducible Эта работа
pmSpr pSpr с точечной мутацией C68A Эта работа
WT дикого типа; IPTG, изопропил b-D-1-тиогалактопиранозид
сайт рестрикции.Затем «/ pi-содержащий фрагмент XbaI-HindIII лигировали с фрагментом pTrc99A, расщепленным XbaI-HindIII. spr амплифицировали из геномной ДНК с использованием праймеров 5′-AAAAGGATCCGTCTCGTGTCGCTTGGC-3 ‘, содержащих сайт рестрикции BamHI, и 5′-AAAACTG-CAGCTCGTCAGGATAGCCAAGG-3′, содержащих сайт рестрикции PstI. Затем содержащий spr фрагмент BamHI-PstI лигировали с фрагментом pTrc99A, расщепленным BamHI-PstI. Рестрикционные ферменты были приобретены в New England Bio Labs (Ипсвич, Массачусетс, США). Производное pSpr, pmSpr, было создано для экспрессии мутантного Spr с использованием индуцируемого промотора trc.Точечная мутация была введена путем сайт-направленного мутагенеза pSpr с использованием праймеров 5’-GGTAT CGATGCGTCTGGTTTCGTACAGCG-3 ‘и 5′-CGCTGT ACGAAACCAGACGCATCGATACC-3’. Плазмиды экспресс-
версии Spr и mSpr с меткой FLAG на С-конце (pSpr-F и pmSpr-F, соответственно) были получены из конструкций Spr и mSpr в pTrc99A с использованием того же прямого праймера, что и выше 5′-AAAAGGATCCGTCTCGTGTCGCT TGGC-3 ‘и обратный праймер, содержащий тег 5’-AACTGCAGTCATTTGTCATCGTCATCTTTATAATCT CTAGAGCTGCGGCTGAGAACCCG-3 ‘.Конструкции плазмид подтверждали секвенированием с использованием праймера перед и после клонированного гена.
Очистка и количественный анализ OMV
Если не указано иное, среду (250 мл) инокулировали (разведение 1: 250) из бактериальных культур, выращенных в течение ночи при 37 ° C, и клетки снова выращивали в течение ночи при 37 ° C (~ 16 ч). Ячейки
осаждали на центрифуге Beckman Avanti J-25 (ротор JLA-10.500, 10000 г, 10 мин, 4 ° C) и полученные супернатанты фильтровали (мембрана Durapore с низким связыванием белков, 0.45 мкм поливинилиденфторида, Millipore, Billerica, MA, USA). Фильтраты снова центрифугировали на центрифуге Beck-man Avanti J-25 (ротор JLA-16.250, 38400 г, 3 часа, 4 ° C) с последующим центрифугированием на ультрацентрифуге Beckman Optima TLX (Beckman Coulter, Inc., Индианаполис). , IN, USA), если гранулы не были видны. В этих случаях большая часть супернатанта сливалась, а область, где должен был быть осажденный материал, «ресуспендировали» в остаточном супернатанте и повторно осаждали (TLA 100.3 ротора, 41000 г, 1 час, 4 ° C). Гранулы ресуспендировали в забуференном фосфатом физиологическом растворе Дульбекко с добавлением соли (0,2 моль / л NaCl) и стерилизовали фильтрованием через 0,45 мкм ультра-свободные центробежные фильтры (Millipore). Часть фильтрата помещали на агар LB и инкубировали при 37 ° C в течение ночи, чтобы убедиться, что суспензии не содержат бактерий.
Для количественного определения выхода OMV препараты OMV кипятили в течение 6 минут в 2-кратном буфере Laemelli, разделяли электрофорезом в 15% додецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и окрашивали SYPRO Ruby Red (Molecular Probes, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). ) ночь в темноте.До и после окрашивания гель фиксировали в течение 1 ч в растворе 10% MeOH и 7% уксусной кислоты. Белки, окрашенные рубином, выявляли в УФ-свете. E. coli Omps F / C и A количественно определяли денситометрией (программное обеспечение NIH Image J, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США). Значения плотности белка внешней мембраны (Omp) были разделены на OD600 исходной культуры для расчета продукции OMV, и это значение было разделено на продукцию OMV штамма WT или необработанного контрольного штамма для определения относительной кратности продукции OMV.
Очистка PG, расщепление и количественное определение ковалентно сшитого Lpp
Если не указано иное, среду (500 мл) инокулировали (разведение 1: 250) от бактериальных культур при 37 ° C в течение ночи и культур, выращенных при 37 ° C до тех пор, пока они не достигли OD600 ~ 0,4. Мешки были выделены из бульонных культур в соответствии с протоколом Lam et al. (2009). Вкратце, клетки осаждали и ресуспендировали в PBS, после чего охлажденные льдом суспензии добавляли по каплям в равном объеме при энергичном перемешивании и кипячении 10% SDS.Образцы кипятили в течение 4 ч, а затем инкубировали при 37 ° C, непрерывно встряхивая, в течение ночи. На следующий день PG осаждали на ультрацентрифуге Beckman Optima TLX (ротор TLA 100.3, 80 000 г, 15 мин, 30 ° C), ресуспендировали в 1% SDS с последующим кипячением еще в течение 2 часов. PG промывали четыре раза деионизированной водой и, наконец, ресуспендировали в равных объемах деионизированной воды.
Равные фракции очищенных мешочков переваривали лизоцимом куриных яиц 15 мг / мл (Sigma-Aldrich, St.Луи,
MO, USA) в 10 ммоль / л Tris-HCL, pH 8, при комнатной температуре в течение 2 дней. Расщепленные лизоцимом PG разделяли с помощью 15% SDS-PAGE, и Lpp определяли иммуноблоттингом и количественно определяли денситометрией (программное обеспечение NIH Image J). Значения плотности Lpp были разделены на OD600 исходной культуры для расчета количества Lpp, который был ковалентно сшит с PG, и это значение было разделено на PG-сшитый Lpp штамма WT или необработанного контрольного штамма на определить относительную складку связанного Lpp.
Концентрацию свободного Lpp в образцах определяли кипячением образцов цельных клеток в буфере Laemelli и 1% SDS в PBS без лизоцима перед SDS-PAGE (Cowles et al. 2011). Lpp был обнаружен иммуноблоттингом с использованием антитела против Lpp (Cowles et al. 2011; предоставлено лабораторией Silhavy) и количественно определен денситометрией (программа NIH Image J). Значения плотности полосы Lpp были разделены на OD600 исходной культуры для расчета количества свободного Lpp, и это значение было разделено на Lpp штамма WT для определения относительной кратности свободного Lpp.Мы решили нормализовать связанный Lpp до OD600, а не традиционный метод (отношение связанного Lpp к общему PG), так как это обеспечивает лучшую меру количества связей OM-PG на ячейку, а не количества связей OM-PG на каждую ячейку. количество PG (которое может различаться по толщине). Следовательно, это значение может отражать, насколько легко OM может отпочковаться как OMV.
Статистика
Параметры, используемые для Т-теста, представляют собой равную дисперсию из-за сравнения идентичных экспериментальных повторений или неравную дисперсию из-за разных экспериментальных повторений и двуххвостового распределения.Для прямого сравнения размера выборки использовался парный Т-тест, а для кратного сравнения — непарный. Значение T-критерия <0,05 считалось статистически значимым; если значение было ниже 0,05, значение значимости приводится под соответствующими данными. Количество повторений каждого эксперимента (n) указано в подписях к рисункам.
Результаты
Делеция в spr специфически подавляет фенотип гипервезикуляции мутанта \ nlpl
Во-первых, мы убедились, что, как и обнаруженный ранее мутант по вставке N-концевого транспозона, E.coli с полной делецией мутанта nlpl (Anlpl) гипервезикулирован (фиг. 1A) и может быть дополнен плазмидой с высокой копией экспрессии (pTrc99A), несущей nlpl (pNlpI). OMV очищали и количественно определяли с помощью ранее установленных методов (McBroom et al. 2006). Неиндуцированная экспрессия NlpI
WT AnlplAnlpC AnlplAydhO AnlplAyafL AnlplAyebA
Рис. 1. Делеция spr специфически подавляет фенотип гипервезикуляции мутанта DnlpI. (A и B) Относительную кратность продукции OMV в культурах указанных штаммов, выращенных в LB в течение ночи при 37 ° C, определяли путем количественного определения OMV, нормализации до OD600 и деления на OD600-нормализованную продукцию OMV в культуре WT.Статистические сравнения приведены с уровнями WT, если они не обозначены скобками. * P <0,05; n> 3. Планки погрешностей указывают стандартную ошибку среднего (SEM). OMV, везикулы наружной мембраны; Л. Б., Лурия-Бертани; WT, дикий тип.
было достаточно, чтобы почти полностью снизить продукцию OMV до количества, продуцируемого изогенным штаммом WT (рис. S1). Следует отметить, что все штаммы и методы лечения, проанализированные в этом исследовании, были оценены на предмет роста и целостности мембран, как описано ранее (Schwechhei-mer and Kuehn 2013), чтобы мы могли быть уверены, что изменения в уровнях продукции OMV не были вызваны существенными различиями. в плотности или лизисе клеток.Эти данные сведены в Таблицу S1 и полностью включены в Данные S1.
О генетической ассоциации между nlpI и spr сообщалось ранее (Tadokoro et al. 2004), поэтому мы исследовали, влияет ли потеря spr на фенотип сильной гипервезикуляции мутанта AnlpI. Мы обнаружили умеренный фенотип гипервезикуляции для мутанта Dspr и аналогичный умеренный фенотип для двойного мутанта AnlpIAspr (рис. 1А). Следовательно, делеция spr снижает продукцию OMV штаммом AnlpI примерно в 30 раз.
Изучить специфичность делеции spr в отношении подавления AnlpI-ассоциированной гипервезикуляции
Фенотип
, делеционные мутации в nlpA, dsbA и bolA были введены в штамм AnlpI. В отличие от их способности частично подавлять другой гипервезикулирующий мутант, AdegP (Schwechheimer and Kuehn, 2013), и в отличие от делеции в spr, ни одна из этих делеций не влияла на фенотип гипервезикуляции мутанта AnlpI (рис.1А). Для дальнейшего изучения специфичности взаимодействия spr и nlpI мы определили, могут ли делеции в генах, кодирующих три структурных и / или функциональных гомолога Spr, ydhO, yafL и yebA (Singh et al. 2012), также подавлять фенотип гипервезикуляции. мутации AnlpI. Среди этого семейства только делеция spr снижала продукцию OMV мутанта AnlpI (рис. 1A и B).
Подавление термочувствительного роста мутантов spr может быть достигнуто не только за счет потери nlpI, но также за счет сверхэкспрессии пенициллин-связывающего белка (PBP) 7, другой DD-эндопептидазы муреина, кодируемой pbpG (Romeis and Holtje 1994; Тадокоро и др.2004 г.). Эти фенотипы предполагают, что NlpI может играть роль в негативной регуляции активности PBP7. Однако, когда мы исследовали, может ли делеция pbpG снижать продукцию OMV мутанта AnlpI, мы обнаружили, что это не так (рис. S2A). Вместе эти данные демонстрируют особую роль Spr в продукции OMV по отношению к NlpI.
Гипервезикуляция с помощью DdegP не зависит от пути nlpI / spr
Затем мы исследовали обратный вопрос: снижает ли делеция spr продукцию OMV для любого другого гипервезикулирующего мутанта.Мы исследовали продукцию OMV для двойного мутанта AsprAdegP и обнаружили, что потеря spr не влияла на гипервезикуляцию, вызванную делецией degP (рис. 2), что дополнительно подтверждает специфическую взаимосвязь между nlpI и spr.
£ * O ~ 4c
WT AdegP AsprAdegP AnlplAsprAdegP
Рисунок 2. Делеция degP вызывает гипервезикуляцию у мутанта AnlpIAspr. Относительную кратность продукции OMV в культурах указанных штаммов определяли, как показано на рисунке 1.Статистические сравнения приведены с уровнями WT. * P <0,05; WT, n> 5. Планки погрешностей указывают на SEM. OMV, везикулы наружной мембраны; WT, дикий тип.
Чтобы понять специфичность мутантного фенотипа AnlpIAspr, нам также необходимо было рассмотреть, предотвращает ли двойная мутация AnlpIAspr способность к избыточному продуцированию OMV, возможно, из-за потери некоторых критических функциональных компонентов. Чтобы решить эту проблему, мы проверили, может ли фенотип гипервезикуляции мутанта AdegP подавляться двойной мутацией AnlpIAspr.Данные демонстрируют, что тройной мутант действительно может гипервезикулировать (Рис. 2) и согласуется с неспособностью мутаций в nlpA, dsbA и bolA влиять на фенотип AnlpI (Рис. 1A). Вместе эти результаты показали, что spr и nlpI функционируют в пути продукции OMV, который не зависит от пути, ведущего к гипервезикуляции с помощью AdegP.
\ nlpl чувствителен к ингибитору синтеза PG, и чувствительность специфически подавляется Dspr
.
Поскольку Spr недавно был идентифицирован как PG DD-эндопептидаза (Singh et al.2012), и потеря spr специфически подавляла гипервезикуляцию, связанную с мутацией AnlpI, мы предположили, что повышенная продукция OMV мутанта AnlpI может быть результатом увеличения деградации PG из-за неконтролируемой активности Spr у мутанта. Поскольку PG важен (Weidel and Pelzer 1964; Vollmer and Bertsche 2008), отсюда следует, что непрерывной деградации PG сверхактивным Spr будет противодействовать активация синтеза PG. Таким образом, в отсутствие NlpI, непрерывный синтез новых PG, даже в стационарной фазе, вероятно, необходим, чтобы позволить клетке выжить при неконтролируемой Spr-опосредованной деградации PG.
Если синтез PG был усилен у мутанта AnlpI, мы ожидали, что это будет особенно очевидно в стационарной фазе, когда синтез PG обычно незначителен в клетках WT. Чтобы исследовать эту гипотезу, мы сравнили чувствительность культур стационарной фазы к обработке 10 ммоль / л d-метионина (d-Met), который оказывает ингибирующее действие на синтез PG (Caparros et al. 1992; Lam et al. 2009) . В культурах «псевдостационарной фазы» (для этого анализа культуры должны были быть ресуспендированы в свежей среде, поэтому это не было названо «стационарной фазой»), можно было бы ожидать, что 10 ммоль / л d-Met окажет минимальное влияние на Штамм WT из-за низкой скорости синтеза PG, тогда как мутанты с повышенной деградацией PG потребуют увеличения синтеза PG и, следовательно, будут чувствительны и будут демонстрировать снижение плотности культуры.Мы оценили чувствительность культур псевдостационарной фазы мутантных штаммов и штаммов WT к обработке 10 ммоль / л d-Met путем мониторинга OD600. Как и предполагалось, штамм с делецией nlpI был гиперчувствителен к 10 ммоль / л d-Met: через 2 часа OD600 резко упала, тогда как штамм WT не пострадал
(рис. 3А). Чтобы убедиться, что именно потеря nlpI вызвала гиперчувствительность к d-Met, мы дополнили штамм с делецией pNlpI и обнаружили, что неиндуцированной экспрессии NlpI было достаточно для снижения чувствительности d-Met мутанта AnlpI до уровня WT (рис.3Б). Эти данные позволяют предположить, что мутант AnlpI активно синтезирует PG даже в псевдостационарной фазе. Мутант AnlpIAspr показал только умеренное снижение OD600 с 10 ммоль / л d-Met, что указывает на то, что штамм с двойным мутантом менее активен в отношении синтеза PG и более похож на штамм WT (фиг. 3A). Подавление AnlpI-зависимой чувствительности d-Met с помощью делеции в spr подтверждает нашу гипотезу о том, что NlpI негативно регулирует активность Spr.
Для дальнейшего изучения фенотипа гиперчувствительности d-Met мы проанализировали рост мутанта AnlpIAspr, трансформированного либо pSpr (spr в плазмиде экспрессии с высокой копией pTrc99A), либо pNlpI.Как и ожидалось, экспрессия Spr увеличивала гиперчувствительность к d-Met двойного мутанта (рис. 3C), проявляя фенотип, аналогичный фенотипу штамма AnlpI (рис. 3A), тогда как экспрессия NlpI не оказывала большого влияния на d -Met гиперчувствительность (рис. 3C), проявляя фенотип, сходный с фенотипом штамма Aspr (рис. 2A). Эти данные подтверждают гипотезу о том, что нерегулируемая активность Spr может вызывать чувствительность к d-Met в псевдостационарной фазе.
Чтобы снова обратиться к вопросу специфичности, мы исследовали, может ли какой-либо из структурных или функциональных гомологов Spr подавлять чувствительность к d-Met мутанта AnlpI.В соответствии с отсутствием подавления, наблюдаемым для фенотипа гипервезикуляции на фиг. 1B, ни одна из делеций гомолога spr не могла подавлять гиперчувствительность d-Met мутанта AnlpI (фиг. 3D). Мы также исследовали, может ли ApbpG подавлять гиперчувствительность к d-Met мутанта AnlpI. Опять же, как видно для продукции OMV (фиг. S2A), не наблюдалось улучшения роста с d-Met для двойного мутанта AnlpIApbpG (фиг. S2B). Вместе данные о чувствительности d-Met (Figs. 3 и S2B) показывают, что мутант AnlpI обнаруживает spr-зависимые повышенные уровни синтеза PG в псевдостационарной фазе.Результаты согласуются с нашей гипотезой, что клетки, лишенные nlpI, увеличивают синтез PG, чтобы компенсировать повышенную деградацию PG за счет нерегулируемой активности Spr.
Потеря dacB, а не spr, устраняет гиперчувствительность к D-Met мутанта AnlpI в логарифмической фазе
Активность
Spr наиболее важна во время активного роста и деления клеток в логарифмической фазе (Singh et al.2012), поэтому мы предположили, что подавление активности Spr с помощью NlpI будет уменьшено или даже не будет отсутствовать во время логарифмической фазы, когда максимальная активность Spr требуется для клетка.Чтобы проверить это, мы сначала проверили, был ли мутант AnlpI чувствительным
Рисунок 3. Чувствительность к D-Met во время неэкспоненциальной фазы роста указывает на высокий оборот PG в мутанте DnlpI. (A и D) Культуры указанных штаммов выращивали в LB в течение ночи при 37 ° C, клетки осаждали и ресуспендировали в свежем LB (t = 0) ± 10 ммоль / л D-Met, а затем выращивали при 37 ° C. OD600 измеряли ежечасно. Данные представляют собой среднее значение двух независимых экспериментов. (B и C) Культуры указанных штаммов, несущих вектор (pTrc) или плазмиды, кодирующие NlpI или Spr, выращивали в LB в течение ночи при 37 ° C, клетки осаждали и ресуспендировали в свежие LB (t = 0) ± 10 ммоль / л D-Met, а затем выращивали при 37 ° C.OD600 измеряли ежечасно. Данные представляют собой среднее значение двух независимых экспериментов. Л. Б., Лурия-Бертани; PG, пептидогликан.
в d-Met в логарифмической фазе и обнаружил, что это имело место (фиг. 4A). Однако в этих условиях дополнительная делеция spr не спасала (рис. 4А). Точно так же ни один из мутантов-гомологов spr не снижал чувствительность d-Met с делецией nlpI (фиг. 4B). Эти данные предполагают, что NlpI может отрицательно регулировать другую гидролазу PG.
Как упоминалось ранее, было отмечено, что мутанты spr могут быть спасены путем дополнительной мутации nlpI (Tadokoro et al.2004), указывая на то, что облегчение произошло из-за повышенной активности фермента со сходной функцией с Spr, который также негативно регулируется NlpI. Чтобы проверить, можем ли мы идентифицировать ген, ответственный за эту активность, мы сконструировали мутанты с двойной делецией nlpI с каждой из трех дополнительных эндопептидаз E. coli: pbpG, mepA или dacB. Мы обнаружили, что потеря dacB,
Рис. 4. В лог-фазе делеция dacB специфически подавляет чувствительность к D-Met штамма AnlpI.(A-C) Указанные штаммы бактерий выращивали в LB в течение ночи при 37 ° C, инокулировали в свежие LB (t = 0), а затем выращивали при 37 ° C. OD600 измеряли ежечасно. Данные представляют собой среднее значение двух независимых экспериментов. LB, Лурия-Бертани.
Ген
, кодирующий PBP4, подавлял гиперчувствительность к d-Met мутанта AnlpI в логарифмической фазе (фиг. 4C). Эти данные предполагают, что NlpI может отрицательно регулировать активность PBP4 во время активного роста. Более того, это дает правдоподобное объяснение того, почему термочувствительность, связанная с мутацией spr, может быть устранена сверхэкспрессией Pbp7 (Hara et al.1996), функциональный гомолог Pbp4 (Vollmer and Bertsche 2008): если NlpI-ингибирование Pbp4 увеличивается у мутанта spr, то, поскольку Pbp7 также является гидролазой PG, сверхэкспрессия этого гомолога может обеспечить облегчение.
Индуцированная экспрессия функционального Spr приводит к чувствительности к D-Met и гипервезикуляции
Если NlpI действует как негативный регулятор Spr на поздних этапах жизненного цикла бактерий, то сверхэкспрессия Spr должна давать фенотип, аналогичный удалению nlpI.Чтобы проверить это, мы проанализировали культуры стационарной фазы высокоиндуцированного (500 мкмоль / л IPTG) штамма Aspr pSpr. Даже без добавления d-Met сильная индукция Spr приводит к снижению плотности культуры по сравнению со штаммом WT, имитируя чувствительность мутанта AnlpI (фиг. 5A). Как и ожидалось, добавление 10 ммоль / л d-Met оказало дополнительный пагубный эффект на клетки, сверхэкспрессирующие Spr (фиг. 5A). Эти результаты согласуются с чувствительностью к d-Met, наблюдаемой для двойного мутанта AnlpIAspr, дополненного pSpr (рис.3С).
Затем мы хотели установить, была ли активность PG-эндопептидазы Spr в качестве причины этих фенотипов. Мы сконструировали экспрессионную плазмиду, кодирующую Spr (pmSpr) с точечной мутацией в каталитической триаде (Cys68 заменен на Ala, C68A), которая, как ранее было показано, вызывает нарушение активности эндопептидазы PG (Aramini et al. 2008; Singh et al. 2012). ). Чтобы гарантировать, что мутация не мешает экспрессии и локализации ОМ, мы сконструировали C-концевую версию Spr (pSpr-F) с тегом FLAG и мутантную версию Spr (pmSpr-F), чтобы иметь возможность отслеживать местоположение Spr и mSpr. и уровни экспрессии.Тег FLAG не влиял на функцию Spr, поскольку базальная и индуцированная экспрессия (с 500 мкмоль / л IPTG) Aspr pSpr-F дала результаты, очень похожие на результаты, полученные при использовании немаркированной версии (рис. S3 и 5C), хотя продукция OMV наблюдалось, чтобы быть немного выше. И pSpr-F, и pmSpr-F локализованы в OM и экспрессируются сходным образом (фиг. S4), что указывает на то, что мутация C68A не нарушает локализацию или стабильность. Следовательно, любые фенотипы, наблюдаемые для мутанта, будут обусловлены скорее результатом потери активности, чем снижением экспрессии или неправильной локализацией.Когда мы сравнивали эффект обработки 10 ммоль / л d-Met штаммов, экспрессирующих mSpr и Spr, мы наблюдали, что повышенная экспрессия mSpr приводила к умеренному дефекту роста, но далеко не так пагубно, как более
.
WTpTrc AnlplpTn: AsprpTrc AsprpSpr AsprpSpr AsprpSpr Aspr pmSpr
10 пМ 500 пМ 500 пМ
Рисунок 5. Сходная чувствительность к D-Met и фенотипы OMV являются результатом сверхэкспрессии Spr и делеции nlpI.(A и B) Указанные штаммы бактерий, несущих вектор, или плазмиды, кодирующие NlpI, Spr или mSpr, выращивали в LB в течение ночи при 37 ° C (индуцировали при инокуляции, если указано), клетки осаждали и ресуспендировали в свежих LB (t = 0) ± 10 ммоль / л D-Met, а затем выращивали при 37 ° C. OD600 измеряли ежечасно. Данные представляют собой среднее значение двух независимых экспериментов. (C) Относительное кратное производство OMV в культурах указанных штаммов, выращенных в LB в течение ночи при 37 ° C (индуцированное при инокуляции, если указано), определяли, как описано на Фигуре 1.Значения P относятся к сравнениям с WT, если они не обозначены скобками. * P <0,05; n> 3. Планки погрешностей указывают на SEM. OMV, везикулы наружной мембраны; Л. Б., Лурия-Бертани; WT, дикий тип.
функционального Spr (фиг. 5B), что подтверждает гипотезу о том, что именно эндопептидазная активность Spr негативно регулируется NlpI.
Затем мы исследовали, может ли сверхэкспрессия функциональной формы Spr значительно увеличивать продукцию OMV по сравнению со сверхэкспрессией мутантного Spr.Небольшое повышение уровней OMV также ожидалось для мутанта
.
, поскольку мы показали ранее, что повышенная экспрессия белков оболочки в целом может приводить к гипервезикуляции (McBroom and Kuehn 2007; Schwechheimer and Kuehn 2013). Мы обнаружили, что неиндуцированная экспрессия функционального Spr на фоне Dspr дополняет фенотип легкой сверхпродукции OMV штамма Dspr до уровня WT, как и ожидалось, тогда как везикуляция увеличивается в зависимости от концентрации IPTG (рис.5С). Примечательно, что везикуляция, вызванная индуцированным Spr, не достигает уровня мутанта nlpl. Мы подозреваем, что это связано с чувствительностью к ненатуральному времени экспрессии Spr для экспрессируемого плазмидой гена. Когда эксперимент был повторен с mSpr, индуцированным с помощью 500 мкмоль / л IPTG, мы обнаружили, что продукция OMV была немного повышена по сравнению с уровнями WT (как и ожидалось), но значительно меньше, чем функциональная Spr. Таким образом, эти данные подтверждают гипотезу о том, что NlpI негативно и специфично регулирует активность DD-эндопептидазы Spr, влияя на продукцию OMV.
Уровни PG-сшитого Lpp отрицательно коррелируют с уровнями продукции OMV у мутантов \ nlpl и DnlpIDspr
Наше открытие взаимосвязи между производством OMV и оборотом PG привело нас к рассмотрению влияния PG
оборота числа ковалентных сшивок между OM и PG и потенциального последующего влияния на производство OMV. В случае мутанта AnlpI предполагаемая высокая скорость синтеза PG может приводить к низкому количеству поперечных сшивок, вызывая слабо связанный OM и, как следствие, гипервезикуляцию.
Чтобы исследовать эту гипотезу, мы разработали анализ иммуноблоттинга, который использует тот факт, что Lpp, выделенный с очищенными саккулами PG, находится исключительно в его поперечно-сшитой форме. Эта форма исторически называлась «связанной» формой из-за ее ковалентной связи с PG. «Свободная» форма Lpp считается формой, которая заякорена в ОМ через липидную составляющую белка, но не связана ковалентно с PG. После выделения мешочков, переваривания лизоцимом и SDS-PAGE количество связанного Lpp определяли иммуноблоттингом.Цельноклеточный экстракт штамма с делецией lpp, Dlpp, использовали в качестве отрицательного контроля для иммуноблоттинга (фиг. 6A). Чтобы установить, что мы можем различать связанные и свободные формы Lpp, мы использовали тройной мутантный штамм AycfSAybiSAerfK, который экспрессирует только свободный Lpp, потому что в нем отсутствуют ферменты, которые образуют ковалентную связь (Magnet et al. 2007). Сначала мы подтвердили, что аналогичные уровни свободного Lpp присутствовали в цельноклеточных препаратах штамма WT и тройного мутантного штамма (фиг. 6A).Концентрация свободного Lpp в образцах
(A) Целоклеточные очищенные саккулы
свободный Lpp, связанный Lpp
WT AnlpI AnlplAspr WT AnlpI AnlplAspr
Рисунок 6. PG-сшитый Lpp обратно коррелирует с продукцией OMV у мутанта AnlpI, и уровни восстанавливаются при делеции spr. (A) Иммуноблоттинг против Lpp целых клеток и совместно очищенных PG обвиняемых штаммов. Составная фигура, созданная путем перестановки дорожек из одного иммуноблота.(B) Относительную кратность поперечно-сшитых Lpp в культурах указанных штаммов, выращенных в LB до OD600 ~ 0,4 при 37 ° C, определяли путем количественного иммуноблоттинга Lpp, совместно очищенного с PG, нормализации до OD600 и деления на OD600-нормализованное перекрестное соединение. -связанный Lpp в культуре WT. (C) Относительная кратность свободного Lpp в культурах указанных штаммов, выращенных в течение ночи в LB. Значение P относится к сравнению с WT. * P <0,05; n> 3. Планки погрешностей указывают на SEM. OMV, везикулы наружной мембраны; Л. Б., Лурия-Бертани; WT, дикий тип; PG, пептидогликан.
определяли кипячением образцов цельных клеток в буфере Лэм-элли и 1% SDS в PBS без лизоцима перед SDS-PAGE (Cowles et al. 2011). Затем мы выделили и проанализировали очищенные саккулы PG из этих штаммов. Lpp может быть обнаружен в мешках PG штамма WT, тогда как мешочки PG тройного мутанта не содержат детектируемого Lpp (фиг. 6A). Эти данные показали, что этот анализ позволяет избирательно количественно определять связанный Lpp.
Уровни ковалентного перекрестного связывания Lpp в штаммах WT, AnlpI и AnlpIAspr сравнивали с использованием нашего анализа связанного Lpp.Мы обнаружили значительно сниженные уровни (~ 40%) ковалентно сшитого Lpp для штамма AnlpI по сравнению с уровнями WT, однако мы обнаружили уровни WT сшитого Lpp для двойного мутанта AnlpIAspr (рис. 6B). Чтобы установить, что наблюдаемое снижение связанного Lpp у мутанта AnlpI не было отражением общего снижения экспрессии Lpp, мы оценили, было ли соответствующее увеличение уровня свободного Lpp в этом штамме. Мы обнаружили, что действительно уровни свободного Lpp в штамме AnlpI были выше, чем в штамме WT (рис.6С). Чтобы гарантировать, что делеция в nlpI не влияет на локализацию Lpp, мы исследовали, фракционируется ли Lpp с PG в мутанте AycfSAybiSAerfKAnlpI. Lpp фракционировали аналогично для этого мутанта и тройного мутанта, экспрессирующего только свободный Lpp (сравните фиг. 6A и S5A). Эти данные подтверждают нашу гипотезу о том, что NlpI-регуляция Spr-зависимого гидролиза PG влияет на перекрестное связывание Lpp, что, в свою очередь, влияет на продукцию OMV.
Мы далее исследовали зависимость ковалентного перекрестного связывания Lpp от фенотипа гипервезикуляции AnlpI путем количественной оценки везикуляции мутантного штамма AycfSAybiSAerfKAnlpI.Мы наблюдали небольшое снижение продукции OMV мутанта AycfSAybiSAerfKAnlpI по сравнению с мутантом AycfSAybiSAerfK (рис. S5B). Поскольку потеря nlpI не увеличивала продукцию OMV у тройного мутанта, эти данные дополнительно подтверждают концепцию, что фенотип гипервезикуляции AnlpI зависит от уровней связанных Lpp. На данный момент мы не понимаем снижения продукции OMV у четверного мутанта с
по отношению к тройному мутанту, и для выяснения этого явления необходимы дальнейшие исследования.
Обсуждение
Анализ взаимосвязи архитектуры оболочки и фенотипов везикуляции может помочь пролить свет на молекулярные свойства, участвующие в механизме продукции OMV. Здесь мы исследовали причину сильного фенотипа гипервезикуляции мутантного штамма AnlpI и обнаружили, что были затронуты несколько компонентов оболочки этого мутанта. Данные свидетельствуют о высоком уровне синтеза PG и сниженных уровнях ковалентных сшивок Lpp-OM для мутанта AnlpI по сравнению с WT.Результаты согласуются с моделью, в которой NlpI является негативным регулятором PG гидролаз Spr и PBP4, и что мутант компенсирует неконтролируемую активность деградирующих ферментов увеличением синтеза PG. Это увеличение динамики PG может привести к неспособности образовывать достаточные поперечные связи Lpp-OM. Хотя ранее было показано, что делеции в Lpp изменяют продукцию OMV (Suzuki et al. 1978; Cascales et al. 2002; Deatherage et al. 2009), тот факт, что везикуляция может модулироваться косвенно через NlpI через изменения PG и, как следствие, обнаруживаемые различия о связанных уровнях Lpp ранее не сообщалось.
Модель действия NlpI на бактериальную оболочку
Модель предлагается для объяснения фенотипов WT и мутантных штаммов, описанных в этом исследовании (рис. 7). Псевдостационарный фенотип чувствительности d-Met фазы для штамма с делецией nlpI согласуется либо с NlpI, репрессирующим активность эндопептидазы PG, либо с увеличением синтеза PG, поскольку либо повышенная регуляция обмена PG, либо снижение синтеза PG делает клетки чувствительными к ингибитору синтеза PG. .Эти взаимодействия могут быть прямыми или косвенными. Модель репрессии подтверждается данными, демонстрирующими сильную сверхэкспрессию Spr, но не мутантного Spr, лишенного активности эндопептидазы,
Рисунок 7. Модель регуляторного взаимодействия NlpI. Предлагаемая модель, которая поддерживает фенотипические наблюдения. В клетках WT NlpI прямо или косвенно контролирует активность эндопептидазы PBP4 и Spr для поддержания динамики PG дикого типа (расщепление и синтез), сшивки Lpp-PG успевают сформироваться, и образуются базальные уровни OMV.У мутанта nlpI активность Spr не контролируется, что приводит к «компенсаторному» увеличению синтеза PG, снижению способности образовывать поперечные связи Lpp-PG и, как следствие, увеличению продукции OMV. В двойном мутанте nlpI spr отсутствие увеличения активности Spr препятствует «компенсаторному» увеличению синтеза PG в стационарной фазе, однако неконтролируемая активность PBP4 приводит к увеличению синтеза PG в логарифмической фазе с относительно незначительными последующими эффектами на продукцию OMV. . У двойного мутанта nlpI dacB отсутствие активности PBP4 препятствует «компенсаторному» увеличению синтеза PG в логарифмической фазе, хотя активность эндопептидазы Spr возрастает с последующими последствиями, такими же, как у мутанта nlpI.У мутанта spr синтез PG, поперечные сшивки Lpp-PG и фенотипы OMV аналогичны фенотипам двойного мутанта nlpI spr за исключением того, что он имеет более контролируемую активность PBP4 во время фазы log, хотя потеря spr может в некоторой степени компенсироваться изменениями в активности PBP4.
Активность PBP4
Активность NlpI * расщепление PG —
\ * Sprac.= выше / ниже уровня WT
приводит к сходным фенотипам с мутантом AnlpI. Для логофазных клеток NlpI не действует через spr, вместо этого он действует через dacB, чтобы модулировать динамику PG.
Вероятно, что увеличение деградации и синтеза PG может сопровождаться снижением уровней перекрестного связывания Lpp. Может просто не хватить времени для установления концентрации WT ковалентно сшитого Lpp в оболочке мутантных клеток, поскольку известно, что сшивание является относительно медленным процессом (Hiemstra et al.1986). Также было показано, что незначительной активностью Spr является расщепление поперечных связей mDAP-d-Ala между стволовыми пептидами PG, в результате чего образуются трипептиды (Singh et al. 2012), которые, как предполагается, не могут служить субстратами для Lpp- Сшивание PG. Следствием меньшего количества поперечных сшивок будет ослабление OM и гиперпродукция OMV. Для более подробного изучения модуляции процессов, происходящих в различных мутантных фонах, на основе наших рабочих моделей, см. Рисунок 7.
Хотя индуцированная внехромосомная экспрессия функционального Spr была значительно более вредной для роста культур, обработанных d-Met, интересно, что сверхэкспрессия как функционального Spr, так и неактивного мутантного mSpr вызывала дефект роста в отсутствие d-Met (рис. 5A и Б). Неудивительно, что повышенные уровни фермента деградации PG имеют вредные последствия, поскольку PG важен для жизнеспособности (Vollmer and Bertsche 2008), но мы были довольно удивлены, что неактивная мутантная форма показала тот же фенотип.Принимая во внимание этот результат, мы предполагаем, что mSpr может хорошо связываться с PG в качестве субстрата, но затем вмешиваться в гомеостаз PG из-за его неспособности расщепляться и, следовательно, диссоциировать от PG. Альтернативно, небольшой дефект роста может быть связан со стрессом оболочки, возникающим в результате увеличения содержания белка, как очевидно из фенотипа гипервезикуляции (Fig. 5C), который связан с сверхэкспрессией белков оболочки (Schwechheimer and Kuehn 2013).
Понимание производства и регулирования OMV клетками WT
Как эти данные о мутантных фенотипах и супрессорах могут прояснить механизм и модуляцию продукции OMV клетками WT? Представленные здесь данные показывают, что один из путей изменения везикуляции — это модуляция структуры PG и, следовательно, связанного Lpp.Мы предполагаем, что в клетках WT равновесие между синтезом и деградацией PG может определять концентрацию ковалентно сшитого Lpp, и что уровни связанных Lpp обратным образом влияют на продукцию OMV. Следовательно, локализованное или крупномасштабное нарушение равновесия ремоделирования PG может изменить связанные уровни Lpp,
и, соответственно, уровни производства OMV. В нормально растущих бактериях WT, вероятно, имеются участки PG, которые активно ремоделируются и, следовательно, имеют повышенную вероятность быть сайтами конститутивного почкования OMV из-за отсутствия поперечных связей LPP-PG.Количество и расположение этих пятен может варьироваться в зависимости от фазы роста. Предполагается, что действуя через PBP4 во время логарифмической фазы и через Spr во время стационарной фазы, NlpI может модулировать (прямо или косвенно), по крайней мере, часть динамики PG. Затем, чтобы вызвать всплеск пузырьков во время стресса окружающей среды или способствовать доставке фактора вирулентности, клетки WT могут изменять перекрестное связывание PG-OM посредством более драматической и / или более длительно действующей модуляции обмена PG.
Присутствие по крайней мере еще одного отдельного пути, который приводит к продукции OMV, было выявлено из того факта, что потеря nlpI и spr не подавляла фенотип гипервезикуляции AdegP, и что гипервезикуляция мутанта AnlpI не могла подавляться с помощью делеция в nlpA, dsbA или bolA (рис.1A и 2), тогда как они подавляют гипервезикуляцию у мутантов AdegP (Schwechheimer and Kuehn 2013). Этот путь включает накопление белка в периплазме и отсутствие изменений общих уровней сшивания Lpp-OM (Schwechheimer et al. 2014).
В целом, наши данные позволяют по-новому взглянуть на сложные взаимодействия, которые управляют структурой клеточной оболочки и биогенезом OMV. Необходима дальнейшая работа, чтобы определить, сохраняются ли эти принципы у грамотрицательных бактерий.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом 5R01GM099471 Национальных институтов здравоохранения (NIH). Мы благодарны за щедрый вклад антитела Lpp Тома Силхави (Принстонский университет), клонирование NlpI в экспрессионную плазмиду Адамом Кулпом (Университет Дьюка) и количественное определение цельноклеточного Lpp в фоне AnlpIAspr Кэтрин Боннингтон (Дюк Университет).
Конфликт интересов
Не объявлено.Список литературы
Арамини, Дж. М., П. Росси, Ю. Дж. Хуанг, Л. Чжао, М. Цзян, М.
Maglaqui, et al. 2008. Структура ЯМР раствора NlpC /
.
Домен P60 липопротеина Spr из Escherichia coli:
структурные доказательства новой каталитической цистеинпептидазы
триада. Биохимия 47: 9715-9717.
Баба, Т., Т. Ара, М. Хасегава, Ю. Такаи, Ю. Окумура, М.Баба и др. 2006. Конструирование инфрамы Escherichia coli K-12, нокаут-мутантов по одному гену: коллекция Кейо. Мол. Syst. Биол. 2: 0008.
Бардуэлл, Дж. К., Дж. О. Ли, Дж. Джандер, Н. Мартин, Д. Белин и Дж. Беквит. 1993. Путь образования дисульфидной связи in vivo. Proc. Natl. Акад. Sci. США 90: 1038-1042.
Берлеман Дж. И М. Ауэр. 2013. Роль бактериальных везикул наружной мембраны для внутри- и межвидовой доставки. Environ. Microbiol.15: 347-354.
Беверидж, Т. Дж. 1999. Структуры грамотрицательных клеточных стенок и производных от них мембранных везикул. J. Bacteriol. 181: 47254733.
Браун В. и К. Рен. 1969. Химическая характеристика, пространственное распределение и функция липопротеина (муреин-липопротеин) клеточной стенки E. coli. Специфическое влияние трипсина на структуру мембраны. Евро. J. Biochem. 10: 426-438.
Браун В. и Х. Вольф. 1975. Присоединение липопротеина к муреину (пептидогликану) Escherichia coli в присутствии и в отсутствие пенициллина FL 1060.J. Bacteriol. 123: 888897.
Капаррос М., А. Г. Писабарро и М. А. де Педро. 1992. Влияние D-аминокислот на структуру и синтез пептидогликана в Escherichia coli. J. Bacteriol. 174: 5549-5559.
Cascales, E., A. Bernadac, M. Gavioli, J. C. Lazzaroni и R. Lloubes. 2002. Pal липопротеин Escherichia coli играет важную роль в целостности внешней мембраны. J. Bacteriol. 184: 754-759.
Черепанов П.П., У.Wackernagel. 1995. Джин
в кассетах Escherichia coli: TcR и KmR с возможностью катализированного Flp иссечения детерминанты устойчивости к антибиотикам. Ген 158: 9-14.
Коулз, К. Э., Й. Ли, М. Ф. Земмельхак, И. М. Кристя и Т. Дж. Силхави. 2011. Свободные и связанные формы Lpp занимают различные субклеточные местоположения в Escherichia coli. Мол. Microbiol. 79: 1168-1181.
Deatherage, B. L., and B. T. Cookson.2012. Высвобождение мембранных пузырьков у бактерий, эукариот и архей: консервативный, но недооцененный аспект микробной жизни. Заразить. Иммун. 80: 1948-1957.
Деатераж, Б. Л., Дж. К. Лара, Т. Бергсбакен, С. Л. Рассулиан Барретт, С. Лара и Б. Т. Куксон. 2009. Биогенез бактериальных мембранных везикул. Мол. Microbiol. 72: 1395-1407.
Ellis, T. N., and M. J. Kuehn. 2010. Вирулентность и
иммуномодулирующая роль везикул наружной мембраны бактерий.Microbiol. Мол. Биол. Откровение 74: 81-94.
Фрейре П., Х. Л. Виейра, А. Р. Фуртадо, М. А. де Педро и К. М. Аррайано. 2006. Влияние морфогена bolA на проницаемость внешней мембраны Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 260: 106-111.
П. Фрейре, Р. Н. Морейра и К. М. Аррайано. 2009. BolA подавляет удлинение клеток и регулирует уровни экспрессии MreB. J. Mol. Биол. 385: 1345-1351.
Хара, Х., Н. Абэ, М.Накакодзи, Ю. Нисимура и К. Хориучи. 1996. Избыточное производство пенициллин-связывающего белка 7 подавляет дефект термочувствительного роста при низкой осмолярности из-за мутации spr Escherichia coli. Microb. Устойчивость к наркотикам. 2: 63-72. Hiemstra, H., M. J. de Hoop, M. Inouye и B. Witholt. 1986. Кинетика индукции и распределение липопротеинов Escherichia coli на поверхности клеток под контролем промотора lac. J. Bacteriol. 168: 140-151. Камитани, С., Я. Акияма и К. Ито. 1992. Идентификация и характеристика гена Escherichia coli, необходимого для образования правильно свернутой щелочной фосфатазы, периплазматического фермента.EMBO J. 11: 57-62. Kulp, A., and M. J. Kuehn. 2010. Биологические функции и биогенез секретируемых бактериальных везикул наружной мембраны. Анну. Rev. Microbiol. 64: 163-184. Лам, Х., Д. С. О, Ф. Кава, К. Н. Такач, Дж. Кларди, М. А. де Педро и др. 2009. D-аминокислоты управляют ремоделированием клеточной стенки стационарной фазы у бактерий. Science 325: 1552-1555. Макдональд, И. А. и М. Дж. Куен. 2013a. Нападение и защита: микробные мембранные везикулы действуют в обоих направлениях. Res. Microbiol. 163: 607-618. Макдональд, И.А., и М.J. Kuehn. 2013b. Вызванное стрессом образование пузырьков внешней мембраны Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 195: 2971-2981. Магнит, С., С. Белле, Л. Дубост, М. Фуржо, Ж. Л.
Mainardi, S. Petit-Frere, et al. 2007. Идентификация L, D-транспептидаз, ответственных за прикрепление липопротеина Брауна к пептидогликану Escherichia coli. J. Bacteriol. 189: 3927-3931.18. Manning, A.J. и M.J. Kuehn. 2011. Вклад везикул наружной мембраны бактерий во врожденную бактериальную защиту.BMC Microbiol. 11: 258. Р. Маредиа, Н. Девинени, П. Ленц, С. Ф. Далло, Дж. Ю, Н. Гюнцель и др. 2012. Везикуляция из синегнойной палочки под SOS. ScientificWorldJournal 2012: 402919. McBroom, A.J. и M.J. Kuehn. 2007. Высвобождение везикул наружной мембраны грамотрицательными бактериями является новой реакцией оболочки на стресс. Мол. Microbiol. 63: 545-558. МакБрум, А.Дж., А.П. Джонсон, С. Вемулапалли и М. Дж. Куен. 2006. Продукция пузырьков внешней мембраны Escherichia coli не зависит от нестабильности мембраны.J. Bacteriol. 188: 5385-5392. Мак-Магон, К. Дж., М. Э. Кастелли, Э. Г. Вескови и М. Ф. Фельдман. 2012. Биогенез везикул наружной мембраны у Serratia marcescens терморегулируется и может быть индуцирован активацией фосфорелейной системы Rcs. J. Bacteriol. 194: 3241-3249. Охара М., Х. С. Ву, К. Шанкаран и П. Д. Рик. 1999. Идентификация и характеристика нового липопротеина, NlpI, в Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 181: 4318-4325. Ортега Дж., Дж. Иванчик и А. Джомаа. 2009. Escherichia coli DegP: структурно-управляемая функциональная модель.J. Bacteriol. 191: 4705-4713.
Пирс, А., Д. Жиллетт и П. Дж. Джонс. 2011. Белок холодового шока CsdA Escherichia coli увеличивает септацию и, как следствие, образование коккобацилл при низкой температуре. Arch. Microbiol. 193: 373-384.
Райвио, Т. Л., и Т. Дж. Сильхави. 2001. Периплазматический стресс и сигма-факторы ECF. Анну. Rev. Microbiol. 55: 591-624.
Romeis, T., and J. V. Holtje. 1994. Пенициллин-связывающий белок 7/8 Escherichia coli представляет собой DD-эндопептидазу.Евро. J. Biochem. 224: 597-604.
Schooling, S. R. и T. J. Beveridge. 2006. Мембранные везикулы: упускаемый из виду компонент матриксов биопленок. J. Bacteriol. 188: 5945-5957.
Schwechheimer, C., and M. J. Kuehn. 2013. Синтетический эффект между стрессом оболочки и отсутствием образования пузырьков внешней мембраны у Escherichia coli. J. Bacteriol. 195: 4161-4173.
Schwechheimer, C., C. J. Sullivan и M. J. Kuehn. 2013. Контроль оболочки производства везикул наружной мембраны у грамотрицательных бактерий.Биохимия 52: 3031-3040.
Schwechheimer, C., A. Kulp, and M. J. Kuehn. 2014. Модуляция продукции пузырьков внешней мембраны бактерий структурой и содержимым оболочки. BMC Microbiol. 14: 324.
Силхави, Т. Дж., М. Л. Берман, Л. В. Энквист, и лаборатория Колд-Спринг-Харбор. 1984. Эксперименты со слияниями генов. Лаборатория Колд-Спринг-Харбор, (Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк,
)
Силхави, Т. Дж., Д. Канн и С. Уокер. 2010 г.Оболочка бактериальной клетки. Харб Холодного источника. Перспектива. Биол. 2: a000414.
Сингх, С. К., Л. Сайри, Р. Н. Амрута и М. Редди. 2012. Три повторяющиеся эндопептидазы муреина катализируют важную стадию расщепления в синтезе пептидогликана Escherichia coli K12. Мол. Microbiol. 86: 1036-1051.
Spiess, C., A. Beil и M. Ehrmann. 1999. Температурно-зависимый переход от шаперона к протеазе в широко консервативном белке теплового шока. Ячейка 97: 339-347.
Судзуки, Х., Ю. Нисимура, С. Ясуда, А. Нисимура, М. Ямада и Ю. Хирота. 1978. Муреин-липопротеин Escherichia coli: белок, участвующий в стабилизации оболочки бактериальной клетки. Мол. Genet Genet. 167: 1-9.
Тадокоро, А., Х. Хаяси, Т. Кишимото, Ю. Макино, С. Фудзисаки и Ю. Нисимура. 2004. Взаимодействие липопротеина NlpI Escherichia coli с периплазматической протеазой Prc (Tsp). J. Biochem. (Токио) 135: 185-191.
Таширо, Ю., Р. Сакаи, М. Тойофуку, И. Савада, Т. Накадзима-Камбе, Х. Учияма и др. 2009. Наружные мембраны и регуляторы синтеза альгината контролируют продукцию мембранных везикул у Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 191: 7509-7519.
Унипрот Консоршн. 2015. UniProt: центр информации о белках. Nucleic Acids Res. 43: D204-D212.
Weidel, W., and H. Pelzer. 1964. Мешковидные макромолекулы — новый взгляд на стенки бактериальных клеток. Adv. Энзимол. Relat.Районы Мол. Биол. 26: 193-232.
Х. Ёдзава, Т. Осаки, С. Курата, М. Фукуда, Х. Каваками, К. Очиай и др. 2009. Везикулы наружной мембраны №
.
Helicobacter pylori TK1402 участвуют в образовании биопленок. BMC Microbiol. 9: 197. Чжан З., Дж. Н. Файге, А. Б. Чанг, И. Дж. Андерсон, В. М. Бродянски, А. Г. Витрещак и др. 2003. Переносчик Escherichia coli, специфичный для L- и D-метионина, является прототипом нового семейства в суперсемействе ABC.Arch. Microbiol. 180: 88-100.
Дополнительная информация
Дополнительную вспомогательную информацию можно найти в онлайн-версии этой статьи:
Данные S1. Экспериментальные процедуры.
Рисунок S1. Дополнение NlpI. Относительную кратность продукции OMV в культурах указанных штаммов с плазмидой pTrc (pT) или плазмидой экспрессии NlpI (pNlpI), выращенной в LB в течение ночи при 37 ° C, определяли путем количественного определения OMV, нормализации до OD600 и деления на OD600-нормализованные. Производство OMV в культуре WT.* P <0,05; n = 3. Планки погрешностей указывают стандартную ошибку среднего (SEM).
Рисунок S2. Делеция pbpG не подавляет фенотипы мутанта DnlpI. (A) Относительную кратность продукции OMV в культурах указанных штаммов, выращенных в LB в течение ночи при 37 ° C, определяли путем количественного определения OMV, нормализации до OD600 и деления на OD600-нормализованную продукцию OMV в культуре WT. * P <0,05; n = 3. Планки погрешностей указывают на SEM. (B) Культуры указанных штаммов выращивали в LB в течение ночи при 37 ° C, клетки осаждали и ресуспендировали в свежем LB (t = 0) ± 10 ммоль / л d-Met, а затем выращивали при 37 ° C.OD600 измеряли ежечасно. Данные представляют собой среднее значение двух независимых экспериментов.
Рисунок S3. Spr-F может стимулировать производство OMV. Относительную кратность продукции OMV в культурах указанных штаммов, выращенных в LB в течение ночи при 37 ° C, определяли путем количественного определения OMV, нормализации до OD600 и деления на OD600-нормализованную продукцию OMV в культуре WT. * P <0,05; n = 3. Планки погрешностей указывают на SEM. Рисунок S4. Локализация и экспрессия Spr-F и mSpr-F. (A и B) Иммуноблоты против FLAG целых клеток (дорожка 1) и клеточных фракций (дорожки 2-7) культур Aspr pSpr-FLAG и Aspr pmSpr-FLAG, индуцированных 500 мкмоль / л IPTG, разделенных с помощью SDS-PAGE.Стандарты молекулярной массы (M) выделены: *, 25 кДа; >, 20 кДа. Фракции получали, как описано ранее (Kesty, N.C. и M.J. Kuehn. 2004. Включение гетерологичной внешней мембраны и периплазматических белков в везикулы внешней мембраны Escherichia coli. J. Biol. Chem. 279: 2069-2076).
Рисунок S5. Гипервезикуляция AnlpI зависит от потери связанного Lpp. (A) Иммуноблоттинг целых клеток против Lpp и
совместно очищенных PG обвиняемых штаммов.Составная фигура, созданная путем перестановки дорожек из одного иммуноблота. (B) Относительную кратность продукции OMV в культурах указанных штаммов, выращенных в LB в течение ночи при 37 ° C, определяли путем количественного определения OMV, нормализации до OD600 и деления на OD600-нормализованные OMV pro-
.
дукции в культуре WT. * P <0,05; n = 3. Планки погрешностей указывают на SEM.
Таблица S1. Резюме роста и целостности мембраны
фенотипа мутантных и обработанных культур.
Таблица S2. Штаммы используются только в дополнительном материале.
1xnf — Протеопедия, жизнь в 3D
Структурные особенности
Функция
[NLPI_ECOLI] Может участвовать в делении клеток. Может играть роль в бактериальной септации или регуляции деградации клеточной стенки во время деления клеток. Отрицательно контролирует выработку внеклеточной ДНК (еДНК). ^[1] ^[2]
Эволюционное сохранение
Проверка, как определено ConSurfDB.Вы можете прочитать объяснение метода и полные данные, доступные на ConSurf.
Публикация Резюме из PubMed
Существует несколько различных семейств повторяющихся белков. В каждом из них отдельный структурный мотив повторяется в тандеме для создания удлиненной структуры. Полученные неглобулярные протяженные структуры особенно хорошо подходят для представления большой площади поверхности и для функционирования в качестве доменов взаимодействия. Экспериментально было продемонстрировано, что многие повторяющиеся белки сворачиваются и функционируют как независимые домены.В повторах тетратрикопептида (TPR) повторяющаяся единица представляет собой мотив спираль-поворот-спираль. Большинство мотивов TPR встречаются в виде от трех до более 12 тандемных повторов в различных белках. Большинство структур TPR в банке данных белков представляют собой изолированные домены. Здесь мы представляем структуру высокого разрешения NlpI, первую структуру полного TPR-содержащего белка. Мы показываем, что в этом случае мотивы TPR не сворачиваются и не функционируют как независимый домен, а полностью интегрированы в трехмерную структуру глобулярного белка.Структура NlpI также является первой структурой TPR от прокариота. Он представляет особый интерес, потому что это мембранно-связанный белок, и мутации в нем изменяют септацию и вирулентность.
Кристаллическая структура NlpI. Прокариотический тетратрикопептидный повторяющийся белок с глобулярной складкой., Wilson CG, Kajander T, Regan L FEBS J. 2005 Jan; 272 (1): 166-79. PMID: 15634341 ^[3]
Из MEDLINE® / PubMed®, базы данных Национальной медицинской библиотеки США.
Список литературы
↑ Охара М., Ву ХК, Шанкаран К., Рик П.Д.Идентификация и характеристика нового липопротеина, NlpI, в Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 1999 июл; 181 (14): 4318-25. PMID: 10400590
↑ Санчес-Торрес V, Маеда Т, Вуд ТК. Глобальный регулятор H-NS и липопротеин NlpI влияют на выработку внеклеточной ДНК в Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun. 15 октября 2010 г .; 401 (2): 197-202. doi :, 10.1016 / j.bbrc.2010.09.026. Epub 15 сентября 2010 г. PMID: 20833130 doi: http: //dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2010.09.026
↑ Уилсон К.Г., Каяндер Т., Риган Л.Кристаллическая структура NlpI. Прокариотический тетратрикопептидный повторяющийся белок с глобулярной складкой. FEBS J. 2005, январь; 272 (1): 166-79. PMID: 15634341 doi: 10.1111 / j.1432-1033.2004.04397.x
Zambia Rail инвестирует 10 млн долларов в модернизацию инфраструктуры
Производственная линия приносит 20 вагонов в неделю, КАК МНОГИЕ Африканские железнодорожные системы Zambia Rail (RSZ) пытаются вернуть долю рынка за счет улучшения качества услуг и надежности. Кевин Мэйхью поговорил с генеральным менеджером RSZ, Бэйб Ботана, в головном офисе в Кабве.FTW: Что такое RSZ? BB: Это то, что раньше было Замбийскими железными дорогами до 2003 года, когда она была передана нашей материнской компании New Limpopo Bridge Investments, ныне известной просто как NLPI. Компания, зарегистрированная на Маврикии, владеет акциями за границей, а также в Южной Африке и в марте разорвала связи со Spoornet — до того момента действующим субподрядчиком. Таким образом, RSZ является дочерней компанией NLPI. Он обрабатывает все железнодорожные операции и услуги с использованием железнодорожной инфраструктуры и железнодорожных активов от Ливингстона до Чилалимбобве на границе с ДРК.FTW: Каковы детали концессии? BB: Транспортная концессия рассчитана на 20 лет с возможностью продления еще на пять, а затем еще на пять лет FTW: Каковы были ваши первоначальные цели? ББ: Надежность и безотказность сервиса. Это означало необходимость хороших инвестиций в техническое обслуживание и модернизацию путей и локомотивов, а также в вагоны. Нам также пришлось восстановить железнодорожное сообщение. Все они в течение многих десятилетий не обслуживались. Нашим начальным этапом была первая помощь по переводу всей системы из отделения интенсивной терапии в общую палату.FTW: Вы достигли этого? БМ: Да. По программе первоначальных инвестиций в трек мы преодолели более 500 км. Мы обработали около восьми локомотивов — три уже запущены, а еще пять будут построены к концу этого года. Мы запустили линию по производству вагонов, на которой еженедельно производим около 20 вагонов. FTW: Как вы достигли поставленных бизнес-целей? BB: Идея заключалась в том, чтобы оптимизировать чистые тонно-километры, а также среднее расстояние. Мы не особо ориентируемся на объемы с точки зрения тоннажа.Чем длиннее среднее расстояние с более высокими тоннами на каждый километр перевозки, тем больше денег вы зарабатываете. Это наш бизнес. Железные дороги предназначены для дальних перевозок, а автомобильные — для перевозок на короткие расстояния. FTW: Каковы ваши показатели сейчас? BB: Среднее расстояние составляет почти 500 километров по сравнению с менее чем 300 километрами под железными дорогами Замбии. Что касается чистых тонно-километров, этот показатель сейчас превышает 600 миллионов чистых тонно-километров по сравнению с предыдущим оператором. Таким образом, в целом с точки зрения бизнеса мы достигаем наших целей; с точки зрения капитальных вложений мы почти приближаемся к цели.FTW: Какие фигуры были задействованы в капитальных вложениях? ББ: В долларовом выражении мы инвестировали около десяти миллионов за последние два года. Это составляет 30 миллиардов квач. Мы сочли разумным соблюдать баланс между использованием собственного финансирования и использования имеющихся кредитных ресурсов для выполнения наших первоначальных инвестиционных программ. FTW: Вы ввели регулярные поезда? ББ: Каким бы противоречивым это ни казалось, у нас есть фиксированный график с большой гибкостью. Мы ежедневно курсируем по три грузовых поезда от Ндолы на севере до Ливингстона на юге, а также обеспечиваем промежуточные и фидерные перевозки между крупными транспортными узлами.Хотя в расписании может быть указано время, существует гибкость с точки зрения фактического времени работы, позволяющая учитывать конкретные и сложные требования клиентов. Мы предоставляем услуги по доставке различных товаров, таких как топливо, сахар и даже медь, которые перевозятся на короткие расстояния по дороге по контракту с перевозчиками. Затем мы отправляем его в пункты назначения, которые обслуживает линия. Для этих услуг с нашими клиентами подписаны соглашения об уровне обслуживания.
Наши открытия | Kuehn Lab
Новаторские протоколы, имеющие решающее значение для оценки продукции и функции везикул
Описание физиологических преимуществ продуцирования бактериальных пузырьков для бактерий
Состав и разработка везикул
Реакция хозяина и воспалительные бактериальные пузырьки
Новаторские протоколы, важные для оценки продукции и функции везикул
Научный вопрос
Мы задали вопрос: «Действительно ли эти бактериальные везикулы секретируют отдельные объекты или просто продукты бактериального лизиса?» В 1998 году OMV почти не признавали секретными объектами.В результате большинство исследований было основано на везикулах, выделенных из простого осаждения супернатантов культур, которые, как было обнаружено, содержат бактериальный дебрис, фимбрии, фаги и другой материал, не являющийся везикулярным. Хотя предпосылка об опосредованной пузырьками секреции бактерий оставалась привлекательной, использование такого нечистого препарата загрязняло поле.
Дискавери
Лаборатория Куэна разработала протоколы «золотого стандарта», включающие очистку в градиенте плотности, биохимический анализ липидов и белков и контроль клеточного лизиса, которые имеют решающее значение для подлинной оценки и характеристики продукции и функции везикул.Как пионеры в этой области, мы использовали модельный грамотрицательный организм, E. coli, , чтобы идентифицировать гены, важные для регуляции и производства везикул. Благодаря нашим генетическим скрининговым исследованиям мы обнаружили несколько особенностей оболочки, которые влияют на продукцию везикул (длина LPS, сшивание Lpp-пептидогликанов, NlpI, NlpA, сверхэкспрессия белка оболочки) и показали, что образование пузырьков внешней мембраны бактерий важно для выживания бактерий в условиях стресса.
Дополнительные публикации
Chutkan H, MacDonald I, Manning A, Kuehn, M .«Количественные и качественные препараты бактериальных пузырьков наружной мембраны». Бактериальные методы Глава.
Vogel R, Coumans FA, Maltesen RG, Böing AN, Bonnington KE, Broekman ML, Broom MF, Buzás EI, Christiansen G, Hajji N, Kristensen SR, Kuehn MJ , Lund SM, Maas SL, Nieuwland R, Osteikoetxea X , Schnoor R, Scicluna BJ, Shambrook M, de Vrij J, Mann SI, Hill AF, Pedersen S. «Стандартизованный метод определения концентрации внеклеточных везикул с использованием настраиваемого резистивного импульсного зондирования.” J Экстраклеточные везикулы . 2016 5: 31242
Schwechheimer C, Kuehn MJ . «Синтетический эффект между стрессом оболочки и отсутствием образования пузырьков внешней мембраны у Escherichia coli». Дж. Бактериол . 2013.195 (18): 4161-73.
Schwechheimer C, Kulp A, Kuehn MJ . «Модуляция образования пузырьков внешней мембраны бактерий структурой и содержимым оболочки». BMC Microbiol . 2014. 14 (1): 324.
Schwechheimer C, Rodriguez DL, Kuehn MJ .«NlpI-опосредованная модуляция продукции везикул внешней мембраны за счет динамики пептидогликанов в Escherichia coli». Микробиология Открыть . 2015; 4 (3): 375-89.
Kulp AJ, Sun B, Ai T, Manning AJ, Orench-Rivera N , Schmid AK *, Kuehn MJ * (* равный вклад) «Полногеномная оценка образования везикул внешней мембраны в Escherichia coli. » PloS one . 2015; 10 (9): e0139200
McMillan HM , Rogers N, Wadle A, Hsu-Kim H, Wiesner MR, Kuehn MJ , Hendren CO.«Коммуникация, опосредованная микробными пузырьками: конвергенция для понимания взаимодействий внутри и между сферами жизни. Воздействие на процесс Environ Sci ». Воздействие процессов на окружающую среду . 2021; 23 (5): 664-677.
Характеристика физиологических преимуществ продукции бактериальных пузырьков для бактерий
Научный вопрос
Мы хотели понять, как патогены используют везикулы для распределения факторов вирулентности внутри хозяина и как они модулируют иммунную систему — с еще одним менее очевидным вопросом, почему везикулы производятся непатогенами.
Дискавери
Лаборатория Куэна определила, что образование везикул имеет решающее значение для облегчения смертельного стресса оболочки и что оно может улучшить выживаемость бактерий при воздействии антибиотиков и бактериофагов, действующих на оболочку. Мы обнаружили, что бактериальные везикулы способствуют и поддерживают ремоделирование ЛПС ОМ, которое происходит из-за изменений окружающей среды. Мы также обнаружили, что бактериальные везикулы могут нести груз, снижающий стабильность биопленок как для штамма-продуцента, так и для неродственных случайных бактерий.
Дополнительные публикации
МакБрум А.Дж., Куэн М.Дж. . «Высвобождение везикул наружной мембраны грамотрицательными бактериями — это новая реакция оболочки на стресс». Мол Микробиол . 2007. 63 (2): 545-58.
Мэннинг А.Дж., Куэн М.Дж. . «Вклад везикул наружной мембраны бактерий во врожденную бактериальную защиту». BMC Microbiol . 2011. 11: 258.
Macdonald IA, Kuehn MJ .«Вызванное стрессом образование пузырьков внешней мембраны Pseudomonas aeruginosa». Дж. Бактериол . 2013. 195 (13): 2971-81.
Bonnington, KE, Kuehn MJ . «Производство везикул внешней мембраны способствует ремоделированию LPS и поддержанию внешней мембраны у сальмонелл во время экологических переходов». мБио 2016 7: e01532-16.
Esoda CN , Kuehn MJ . «Лейцинаминопептидаза Pseudomonas aeruginosa влияет на ранний состав и структуру биопленок посредством связанной с везикулами антибиотикопленочной активности.” мБио . 2019 год
Состав и инженерия везикул
Научный вопрос
Мы хотели понять включение груза и то, как взаимодействие с хозяином определяется грузом везикул. Этот тип знаний может способствовать развитию везикул как векторов антигенов для вакцин. Везикулы обогащаются и истощаются в определенных популяциях как липидных, так и белковых молекул, вероятно, в результате событий отбора грузов, происходящих в клеточной оболочке.Используя молекулярные гибриды, мы получили представление о выборе груза везикул, а с помощью сконструированных везикул, которые также несут флуоресцентный груз, зарегистрировали перенос растворимого и мембраносвязанного груза везикул после того, как везикулы взаимодействуют с клетками-хозяевами.
Дискавери
Лаборатория Куэна использовала биохимические методы для исследования ассоциации термолабильного энтеротоксина (LT) с везикулами и поверхностной молекулой бактерий, липополисахаридом (LPS). Мы также изменили состав везикул, чтобы исследовать их функцию и адаптивный иммунный ответ на антигены везикул.
Дополнительные публикации
Kesty NC и Kuehn MJ . «Включение гетерологичной внешней мембраны и периплазматических белков в везикулы внешней мембраны Escherichia coli». J Biol Chem 2004. 279: 2069-76.
Mudrak B, Rodriguez DL, Kuehn MJ . «Остатки термолабильного энтеротоксина, участвующие в связывании поверхности бактериальных клеток». Дж. Бактериол . 2009. 191 (9): 2917-25.
Muralinath M, Kuehn MJ , Roland KL, Curtiss R 3rd.«Иммунизация с использованием везикул внешней мембраны Salmonella enterica serovar Typhimurium, доставляющих пневмококковый белок PspA, обеспечивает защиту от заражения Streptococcus pneumoniae». Заражение иммунной . 2011. 79 (2): 887-94.
МакБрум А.Дж., Куэн М.Дж. . «Высвобождение везикул наружной мембраны грамотрицательными бактериями — это новая реакция оболочки на стресс». Мол Микробиол . 2007. 63 (2): 545-58
.
Оренч-Ривера N , Куен MJ .«Дифференциальная упаковка в пузырьки внешней мембраны при окислительном стрессе выявляет общий механизм селективности груза». Передний микробиол . 2021 12: 561863.
Ответ хозяина на токсические и воспалительные бактериальные пузырьки
Вопрос
По определению, везикулы наружной мембраны представляют собой сложную смесь белков и липидов. Ожидалось, что их способность стимулировать ответ хозяина будет более сложной и, возможно, синергетической, по сравнению с простой смесью растворимых независимых компонентов.
Дискавери
Лаборатория Куена была первой, кто официально оценил эту гипотезу, используя везикулы, выделенные и биохимически проанализированные из культуральных супернатантов различных патогенов, таких как P. aeruginosa , энтеротоксигенные E. coli и H. influenzae . Исходя из этого, мы обнаружили, что мембранный контекст имеет решающее значение для прикрепления и транспортировки везикул внутри эндоцитозного пути хозяина, а также для последующего токсического и / или врожденного иммунного ответа со стороны клетки-хозяина.
Например, везикулы P. aeruginosa , продуцируемые штаммом, выращенным в легких пациента с муковисцидозом, лучше прилипали к легким, чем к эпителиальным клеткам кишечника. Напротив, штамм, выделенный из сыворотки, не показал такого предпочтения в отношении клеток легких. Похоже, что везикулы стимулируют эпителиальные клетки и макрофаги, вызывая цитокиновый ответ, отличный от ответа только на LPS (главный компонент везикул). Мы также обнаружили, что термолабильный энтеротоксин (LT) — важный фактор вирулентности ETEC — экспортируется из клеток, связанных с внешней поверхностью везикул.Представленная в этом контексте клетка способна опосредовать проникновение всей везикулы ETEC в клетки культуры колоректальной ткани человека.
Дополнительные публикации
Bauman SJ, Kuehn M. « Везикулы Pseudomonas aeruginosa связаны с эпителиальными клетками легких человека и интернализуются ими». BMC Microbiol . 2009. 9:26.
Эллис Т.Н., Лейман С.А., Куэн MJ . «Естественно образованные везикулы наружной мембраны из Pseudomonas aeruginosa вызывают мощный врожденный иммунный ответ за счет комбинированного восприятия как липополисахаридных, так и белковых компонентов.” Инфекционный иммунитет . 2010. 78 (9): 3822-31.
Чуткан Н, Куэн МДж . «Контекстно-зависимая кинетика активации, вызванная растворимым и термолабильным энтеротоксином, связанным с везикулами внешней мембраны». Заражение иммунной . 2011. 79 (9): 37609.
Finethy R, Luoma S, Orench-Rivera N , Feeley EM, Haldar AK, Yamamoto M, Kanneganti TD, Kuehn MJ , Coers J. «Активация инфламмасомы бактериальными пузырьками внешней мембраны требует гуанилат-связывающих белков.
No related posts.

НЛП и манипуляция | Ресурсы НЛП

Что такое НЛП

Манипуляция

Этика манипуляции

Системные эффекты

Стратегия «выигрыш-выигрыш»

5 мифов про НЛП с которыми давно пора распрощаться

Почему НЛП — это ключевой инструмент обучения в наше время

Что такое НЛП?

Но как именно НЛП обучение помогает людям?

Моделирование в НЛП

Люди совершенно точно делятся на три категории по отношению к НЛП:

Что же такое НЛП моделирование простыми словами?

«Что такое нлп? Насколько это полезно ? Расскажите по-подробней ?» – Яндекс.Кью

Статья НЛП — это про что?

Что такое техника НЛП, или как запрограммировать себя на успех | Путешествия

НЛП — это…

Когда появилась эта техника?

Как работает НЛП?

Чем еще полезна практика НЛП?

Действительно ли практика помогает достигать успеха?

ОБ НЛП

Психотерапевтическая энциклопедия об НЛП

| НЛПИ

Сообщество | НЛПИ

Участие NlpI в способности NMEC выживать в сыворотке человека ….

1xnf — Протеопедия, жизнь в 3D

Структурные особенности

Функция

Эволюционное сохранение

Публикация Резюме из PubMed

Список литературы

Zambia Rail инвестирует 10 млн долларов в модернизацию инфраструктуры

Наши открытия | Kuehn Lab

Состав и инженерия везикул

Ответ хозяина на токсические и воспалительные бактериальные пузырьки

Написать ответ Отменить ответ