Анкета сср 1 ответы — Анапа-Справка
Анкета сср1 вопросы и ответы. Поэтому любой ответ будет характеризовать вас одинаково хорошо, если вы ответите серьезно и искренне. За любой ответ совпадающий с ключом начисляется 1 балл. Рыбникова Прогноз2 предназначена для определения уровня нервнопсихической. Анкета оценки суицидального риска военнослужащих. Опросник суицидального риска в модификации т. Проставьте количество ответов на анкете. Правильных или неправильных ответов здесь нет, поэтому не старайтесь долго их обдумывать. Социальный паспорт семей учащихся класса. Пятая графа или пятый пункт выражение, употребляемое в переносном смысле, означающее указание в документах национальности как факта принадлежности к определнной этнической общности. Бу хмаоюгры сургутская городская клиническая больница 4. Анкета сср1 вопросы и ответы лучшие новинки. Получите ответы от реальных юристов. Во времена Советского Союза, в пятой графе анкет и документов, указывали.Ответьте на вопросы 1. Именно это указывали в графе 5 в документах и анкетах во времена СССР. Перед тестом выдают буклет с вопросами и анкету для ответов. Есть и такие варианты, которым не соответствует ни один тип мотивации, например, вопрос 10. Именно это указывали в графе 5 в документах и анкетах во времена СССР? Качественный анализ ответов позволяет уточнить. Ответы на игру Вспомни СССР. Обработку данных следует начинать со шкалы искренности, которая используется для оценки достоверности ответов обследуемого. Подскажите как правильно заполнить поле место рождения в анкете на загранпаспорт Подскажите как правильно. Анкета для родителей 1 сентября, сведения. Продолжаем составлять и выкладывать ответы к прохождению игры Вспомни. Распаковывает, что я анкету на завтра, что нужно заверять сегодня. Кроме того, Вы всегда можете просмотреть полный список ответов на игру Назад в. Если военнослужащий получил 10 и более баллов, то использовать данные анкеты не рекомендуется, а причины. Анкета оценки нервнопсихической устойчивости педагога. Вам необходимо внимательно прочитать вопрос и выбрать наиболее подходящий для Вас вариант ответа. Диагностика мотивации достижения А. Где есть тепло, когда и кем он был докинут. 1ая шкала вопросы 1 20 определяет тревожность как психическое. России Вы можете найти в под разделах Вестник Банка России. Сср, отвеьы я каплю на впритирку, ответы нужно сделать сегодня. По моему по шкале искренности от 0 до 7 ответов да норма, анкету защитывают, а более 7 ответов. Проверьте себя прочтите утверждение и дайте ответ да или нет. Автор TAGаМаргарита Герасимова, канал Жизни ВОПРОСЫ T. ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Анкета. Анкета сср1 вопросы и ответы интерпретация результатов теста. Обратно в СССР 1 фото. Анкета сср1 вопросы и ответы спортивная школа. Мне очень тяжело приспособиться к новым условиям жизни, работы, переход к хоть каким новым условиям
Начинать подведение итогов следует с проверки искренности ответов респондента если по данной шкале опрашиваемый набирает 5 и более баллов, результаты.
Анкета сср-1 вопросы и ответы — Реновация
Во времена Советского Союза, в пятой графе анкет и документов, указывали свою национальность. Читать работу по теме ПсиходиагностикаЛ. Чепуха с перепутанными вопросами и ответами Толочкова. Ответы на часто возникающие вопросы при заполнении анкеты дял получения шенгенской визы. Качественный анализ ответов позволяет уточнить отдельные биографические сведения. Вопрос На каком языке следует заполнять анкету? Читаем Лермонтова на улице Лермонтова. Правильный ответ на этот вопрос НАЦИОНАЛЬНОСТЬ. Конечно можно выучить ответы и написать тест. Пристально смотрите за тем, чтоб номер вопроса анкеты и номер клеточки. Вопрос Именно это указывали в графе 5 в документах и анкетах во времена СССР. При ответе на вопросы надо учитывать что в данном тесте нет правильных и неправильных ответов и стараться. Вопросов больше, чем ответов и. Внимательно следите за тем, чтобы номер вопроса анкеты и номер клетки. К каждому вопросу анкеты даны возможные ответы. Ответа на этот вопрос ни один. Здравствуйте, мне интересует вопрос по поводу заполнения анкеты. Мне рекрутерыи лично, и по рассказам, которые токарям и анкеты с треугольничками давали, и докапывались до них. Пятница, После этого подлинные ответы и КИМы ЕГЭ по математике с названиями вроде ЕГЭ 2014 математика. Нужно ли в анкетезаявлении на загранпаспорт указывать старый просроченный загранпаспорт В анкете есть графа Имею заграничный.Анкета оценки нервнопсихической устойчивости Прогноз2. Вопросы и ответы по заполнению анкет на визу США DS160. В анкетах друзья и знакомые помимо ответов на вопросы оставляли свои фотографии, пожелания, рисунки. Ответы на игру Вспомни СССР. Сейчас мы работаем с анкетами в 12 А4, где нужно отразить самую ключевую информацию типа ФИО, телефона, даты рождения. Составить анкету 10 вопросов о предпочтениях молоджи в выборе профессии. Планконспекты занятий и занятий и рефераты. На этот вопрос могут отвечать только зарегистрированные врачи! Непонятно о чем, но достаточно популярный. Будьте откровенны, долго не раздумывайте над содержанием вопросов, давайте естественный ответ.
«Современная архитектура» — иллюстрированный журнал «Государственного издательства», выходивший в Москве с 1926 по 1930 годы 6 раз в год. Журнал освещал вопросы современного градостроительства, жилой, промышленной и сельской архитектуры, типового проектирования, истории и теории архитектуры и строительства. Сыграл одну из главных ролей в пропаганде идей архитектурного конструктивизма, фактически стал печатным органом творческого объединения архитекторов-конструктивистов — Объединения современных архитекторов (ОСА).
Журнал выходил с периодичностью 6 номеров в год. Всего за период 1926—1930 годов вышло 27 номеров «СА», в том числе три сдвоенных. Некоторые выпуски были тематическими: № 6 за 1927 год был посвящён прошедшей в Москве Первой выставке современной архитектуры; в 1929 году темами журнала стали «Современное жильё» (№ 1), «Свет и цвет» (№ 2), «Сооружения культуры и отдыха» (№ 3) и «Днепрострой» (№ 6).
Выпуск журнала был прекращён в 1930 году. В последнем, шестом, номере за 1930 год была опубликована редакционная статья «1926—1930», подводящая итоги пятилетней деятельности «Современной архитектуры» и Объединения современных архитекторов. В том же году прежде самостоятельные архитектурные группы (ОСА, АСНОВА, МАО, ВОПРА, АРУ и другие) вошли на правах секторов в Московское отделение Всесоюзного архитектурно-научного общества (МОВАНО). МОВАНО планировало создать на базе «Современной архитектуры» внегрупповой архитектурный журнал — в том же последнем номере «СА» за 1930 год была напечатана реклама готовящегося к выпуску журнала «Революционная архитектура» («РА»), которая сообщала, что новый журнал «объединяет главнейшие архитектурные течения сектора ВОПРА, АСНОВА, АРУ и ОСА». Однако создать собственный печатный орган МОВАНО не удалось. В 1931 году появился новый архитектурный журнал «Советская архитектура», в состав редколлегии которого вошёл и бывший ответственный редактор «Современной архитектуры» М. Я. Гинзбург.
Ответственными редакторами журнала в 1926—1928 годах были А. А. Веснин и М. Я. Гинзбург. В 1929 году, в связи с выходом постановления Главнауки и Госиздата о выделении во всех научных периодических изданиях только одного ответственного редактора, редакция выбрала ответственным редактором журнала Гинзбурга, а Веснина — редактором «по библиотеке СА» (разделу «Библиография»). Гинзбург указан ответственным редактором всех выпусков журнала за 1929 год. В 1930 году редколлегию вновь возглавили Веснин и Гинзбург. В том же году в составе редакции появилась должность заместителя ответственного редактора, которую занял Р. Я. Хигер.
В состав первой редколлегии журнала кроме Веснина и Гинзбурга входили А. К. Буров, В. А. Веснин, Г. Г. Вегман, И. А. Голосов, А. М. Ган, А. Ф. Лолейт, Г. М. Орлов и И. Н. Соболев. Большинство членов редколлегии работали в журнале на протяжении всего 5-летнего периода его существования; И. А. Голосов и А. Ф. Лолейт вышли из редколлегии в 1926 году. В дальнейшем состав редколлегии несколько раз пополнялся новым членами: В. Н. Владимиров (с № 2, 1926), С. А. Маслих (с № 4, 1926), И. Л. Маца (№ 5—6, 1926), П. И. Новицкий (с № 5—6, 1926), А. Л. Пастернак (с № 3, 1927), А. С. Никольский, М. О. Барщ (с № 4—5, 1927), И. И. Леонидов (с № 1, 1928), Н. А. Красильников, И. И. Муравьёв, Н. Б. Соколов, М. Холостенко, Ф. И. Яловкин, Р. Я. Хигер, А. С. Фисенко (с № 6, 1928). В двух номерах журнала (№ 6, 1928 и № 1, 1929) членом редколлегии указан Ле Корбюзье.
Портал tehne.com в настоящее время формирует электронный полнотекстовый архив всех выпусков журнала «Современная архитектура». Все материалы журнала будут представлены в формате html (распознанный текст + иллюстрации + кликабельные превью страниц) и в формате pdf (факсимильный скан). Ссылки на html-версии статей и pdf-версии номеров смотрите ниже, в оглавлениях выпусков. Раздел находится в процессе наполнения. Для html-версий сохраняется орфография и пунктуация оригинальных текстов, исправляются только очевидные опечатки.
Источники формирования базы данных материалов СА:
Электронные факсимильные версии СА представлены в формате pdf в следующих вариантах:
Оглавления и ссылки на полнотекстовые версии статей
1926. №№ 1, 2, 3, 4, 5–6Современная архитектура. 1926. № 1
Современная архитектура. 1926. № 2Современная архитектура. 1926. № 3Современная архитектура. 1926. № 4Современная архитектура. 1926. № 5—6
1927. №№ 1, 2, 3, 4–5, 6Современная архитектура. 1927. № 1 Современная архитектура. 1927. № 2Современная архитектура. 1927. № 3Современная архитектура. 1927. № 4—5
Современная архитектура. 1927. № 6
1928. №№ 1, 2, 3, 4, 5, 6Современная архитектура. 1928. № 1
Современная архитектура. 1928. № 2
Современная архитектура. 1928. № 3
Современная архитектура. 1928. № 4
Современная архитектура. 1928. № 5
Современная архитектура. 1928. № 6
1929. №№ 1, 2, 3, 4, 5, 6Современная архитектура. 1929. № 1. Современное жилье
Современная архитектура. 1929. № 2. Свет и цвет
Современная архитектура. 1929. № 3. Сооружения культуры и отдыха
Современная архитектура. 1929. № 4
Современная архитектура. 1929. № 5
Современная архитектура. 1929. № 6. Днепрострой
1930. №№ 1—2, 3, 4, 5, 6
Современная архитектура. 1930. № 1—2. Дискуссия о социалистическом расселении
Современная архитектура. 1930. № 3. Дискуссия о социалистическом расселении
Современная архитектура. 1930. № 4
Современная архитектура. 1930. № 5. К дискуссии о дворцах культуры
Современная архитектура. 1930. № 6. Пять лет СА
| Партнёры
Проектирование жилых домов, торгово-развлекательных и многофункциональных комплексов, офисных зданий.
Производитель и официальный партнёр крупнейших поставщиков строительных конструкций: Schuco, Funke Gruppe, AGC. Один из лидеров российского рынка по изготовлению и монтажу светопрозрачных противопожарных конструкций. ООО «АС-Проект» Одна из ведущих проектных компаний Удмуртии и Приволжского федерального округа. АС-Проект выполняет все виды проектных работ и предпроектный анализ участков под застройку. | |
265 вопросов с ответами в SSR
Уважаемый Кумарасвами, на случай, если вам все еще нужно поделиться.
В моей лаборатории мы предпочитаем использовать SDS PAGE для определения аллельного разнообразия для панелей SSR. Мы используем старую версию геля для ручного секвенирования и окрашиваем гель системой окрашивания нитратом серебра.
Мы пробовали агарозную систему, но иногда не могли получить ожидаемое разрешение, а разнообразие аллелей также занижено по сравнению с использованием SDS PAGE.
SDS PAGE хорошо работают в наших условиях.В зависимости от продуктов pcr мы обычно можем разрешить большинство аллелей для оцениваемых локусов ssr.
Некоторые примечания, которые необходимо учитывать:
1) выполнить предварительный размер для диапазонов размеров продуктов pcr для всех пар праймеров ssr,
2) для каждой гелевой пластины мы прогнали продукты двух пар праймеров с достаточной разницей в размерах и нанесли таким образом, образец 1 — это образец 1 с праймером 1, а лунка 2 — это образец 1 с праймером 2 и так далее. Эта схема расположения образца предназначена для предотвращения возможной утечки из одной колонки в другую одной и той же комбинации образца и праймера.Обычно мы запускаем 50 образцов (25 + 25) и два маркера ДНК на чашку,
3) Убедитесь, что образцы загружены в виде однонитевой ДНК после кипячения до 94 ° C, чтобы получить четкие аллельные структуры. Сложные аллельные паттерны, вероятно, связаны с присутствием смеси двухцепочечных и одноцепочечных молекул среди оцениваемого продукта pcr,
4) если ваши образцы содержат более 25 особей на праймер и вам необходимо запустить более одной чашки на праймеры , всегда берите несколько образцов из предыдущих планшетов и используйте их в качестве внутреннего размера аллелей для дополнительных планшетов.Это поможет определить идентичность аллелей среди разных планшетов для одних и тех же праймеров ssr.
Наконец, все предложения действительно поступают в службу поддержки вашей лаборатории. Есть ли в вашей лаборатории только горизонтальный агарозный гель, или ручное секвенирование для SDS PAGE, или автоматический секвенатор ABI PRISM. Более того, каждый подход, который вы решите использовать, будет стоить вам по разному. Следовательно, вы должны использовать то, что доступно в вашей лаборатории и в рамках имеющегося бюджета.
В нашем случае SDS PAGE и устройство для ручного секвенирования плюс окрашивание серебром подходят нам и соответствуют нашему бюджету.Мы регулярно использовали его для решения многих проблем SSR в нашей лаборатории.
Удачи.
Решено — ответы на вопросы о размере выборки
В. Что такое адаптивные клинические испытания?Адаптивные испытания — это любые испытания, в которых изменение или решение вносятся в испытание, пока оно еще продолжается. Адаптивные испытания позволяют постоянно изменять дизайн испытания на основе промежуточных данных, что, в свою очередь, может позволить вам изучить варианты и методы лечения, которые вы в противном случае не смогли бы использовать, которые могут привести к улучшениям в вашем испытании, на основе данных по мере их поступления.Адаптивные дизайны обычно задаются заранее и встроены в первоначальный дизайн исследования.
Примерами адаптивных планов являются последовательные планы групп, переоценка размера выборки, планы обогащения, планы выбора групп и планы адаптивного распределения.
Более подробное объяснение того, что такое адаптивные клинические испытания, смотрите в следующем видео:
Ничего не видно? Нажмите здесь, чтобы принять файлы cookie для воспроизведения видео
В. Почему так важны испытания адаптивного дизайна и какие потенциальные преимущества они имеют?
Адаптивные испытания рассматриваются многими как очень ценное дополнение к набору инструментов для разработки клинических испытаний, поскольку они дают возможность исследователю улучшить исследование на основе всей информации, которая становится доступной. Адаптивный дизайн способствует внесению этих улучшений в исследование в принципиальной и заранее определенной структуре, и, таким образом, можно вносить изменения, не влияя на легитимность исследования. Это концептуально должно позволить нашему испытанию быть ближе к оптимальному испытанию, если результаты были известны заранее, и, таким образом, дать лучшие и потенциально более эффективные выводы.
В результате адаптивные испытания могут снизить затраты, связанные с клиническими испытаниями, за счет увеличения показателей успешности, обеспечивают большую гибкость при добавлении анализов и групп испытаний и позволяют испытаниям заканчиваться раньше, если результаты являются многообещающими или бесперспективными. Это особенно важно сегодня, поскольку процент успешных клинических испытаний в целом снизился, а затраты, связанные с клиническими испытаниями, особенно подтверждающими клиническими испытаниями фазы II, за последние 30 лет возросли.
Более подробное объяснение преимуществ адаптивных клинических испытаний см. В следующем видео:
Ничего не показывает? Нажмите здесь, чтобы принять файлы cookie для воспроизведения видео
В. Каковы потенциальные недостатки адаптивного дизайна?
Адаптивные испытания могут также включать сложные и разные статистические данные и оценки, чем те, которые обычно используются в клинических испытаниях, и поэтому могут потребовать специального программного обеспечения и опыта для внедрения, что может повлечь дополнительные первоначальные затраты.Например, большинство адаптивных дизайнов, используемых в клинических испытаниях, потребуют углубленного моделирования для оценки рабочих характеристик дизайна и ожидаемой частоты ошибок первого типа. Это также может означать, что результаты адаптивного дизайна не могут быть напрямую сопоставимы с результатами исследования с фиксированным сроком. В результате определенные сравнения между исследованиями и метаанализ могут быть затруднены, что может вызвать проблемы с нормативной точки зрения или для общего понимания.
Адаптивные испытания, возможно, потребуют дополнительных логистических затрат.Предвзятость и раскрытие информации являются серьезными проблемами, поскольку обеспечение сохранения слепоты может повлечь за собой дополнительные расходы, а также является серьезным риском для целостности исследования. По мере того, как больше людей будет необходимо просматривать промежуточные данные по мере продвижения испытания, чтобы принимать решения на адаптивной основе, возникает ситуация, когда появляется больше возможностей для изменений, которые могут отрицательно повлиять на величину систематической ошибки в исследовании. В крупных клинических испытаниях больше внимания будет уделяться совместной работе с соответствующим регулирующим органом и независимым комитетом по мониторингу данных (IDMC).
Более подробное объяснение преимуществ и недостатков адаптивных клинических испытаний можно найти в следующем видео:
Ничего не видно? Нажмите здесь, чтобы принять файлы cookie для воспроизведения видео
Q. Адаптивные конструкции более эффективны?
Адаптивный дизайн позволяет клиническим испытаниям быть более гибкими за счет использования результатов, накопленных в испытании, для изменения его курса. Испытания с адаптивным дизайном обычно более эффективны, информативны и могут быть более этичными, чем испытания с традиционным фиксированным дизайном, потому что они часто лучше используют ресурсы, такие как время и деньги, и могут требовать меньшего количества участников.
Адаптивные дизайны также могут быть потенциально менее эффективными, чем испытание с фиксированным сроком или простой адаптивный дизайн, если они спроектированы плохо. Например, планы переоценки размера выборки, которые приводят к более высоким средним размерам выборки при минимальном увеличении вероятности успеха, или планы адаптивного отбора, которые включают дополнительные группы с минимальным предварительным шансом на успех.
В целом, адаптивные конструкции, если их правильно продумать и спланировать, имеют значительные возможности для повышения эффективности испытаний, но дополнительная гибкость может означать больше возможностей для принятия неверных проектных решений.
В. Что такое групповой последовательный дизайн?Групповые последовательные дизайны — это наиболее широко используемый тип адаптивного исследования в подтверждающих клинических исследованиях III фазы. Групповые последовательные планы отличаются от стандартного исследования с фиксированным сроком, позволяя преждевременно завершить исследование на основании предварительно определенного промежуточного анализа эффективности или бесполезности. Групповые последовательные дизайны достигают этого за счет использования метода расходования ошибок, который позволяет установить величину общей ошибки типа I (эффективность) или типа II (бесполезность) при каждом промежуточном анализе.Возможность завершить испытание может помочь снизить затраты, создавая возможность для скорейшего одобрения высокоэффективных методов лечения и прекращения испытаний, которые пока показали очень плохие результаты.
В. Какова оценка бесполезности клинических испытаний?Термин «бесполезность» относится к неспособности клинического испытания достичь своих целей, таких как прекращение клинического испытания, когда промежуточные результаты предполагают, что оно вряд ли достигнет статистической значимости.Это может сэкономить ресурсы, которые затем можно будет использовать в других более перспективных исследованиях.
В. Что такое переоценка размера выборки (SSR)?r-оценка размера выборки (SSR) — это тип адаптивного испытания, в котором можно изменить размер выборки, если это необходимо. Определение размера выборки — это досудебный процесс, который будет проводиться на основе изначально неопределенных параметров планирования (например, дисперсии, размера эффекта), и, таким образом, изменение размера выборки на основе улучшенных промежуточных оценок для этих параметров является очевидной целью адаптации.
SSR может гарантировать получение достаточной мощности для многообещающих результатов в недостаточно мощном исследовании или может гарантировать, что большее количество пациентов получат более качественное лечение или может перейти непосредственно от одной фазы испытания к другой. В совокупности это может сократить использование ресурсов и времени или повысить вероятность успеха испытания.
Существует два основных типа SSR: неслепой SSR и слепой SSR. Основное различие между этими планами состоит в том, что они различаются по тому, являются ли данные слепыми или нет, и параметром планирования, на который нацелена улучшенная промежуточная оценка.
Для более подробного объяснения того, что такое SSR, см. Следующее видео о переоценке размера выборки:
Ничего не отображается? Нажмите здесь, чтобы принять файлы cookie для воспроизведения видео
В. Что такое слепая переоценка размера выборки?
План слепой переоценки размера выборки (SSR) — это гибкий дизайн, основной целью которого является возможность повторно оценить размер выборки в середине исследования, чтобы обеспечить достаточную мощность без исключения промежуточных данных i.е. не позволяя исследователю узнать, из какой группы лечения взяты промежуточные данные.
Поскольку размер эффекта будет слепым, слепой SSR обычно нацелен на мешающие параметры, используемые при определении размера выборки, такие как дисперсия или контрольная пропорция. Хотя оценки этих мешающих параметров могут быть улучшены за счет использования промежуточных данных без слепого анализа, в слепых схемах SSR это улучшение незначительно по сравнению с наилучшей слепой оценкой. Однако при сохранении слепоты логистические и нормативные барьеры для адаптации значительно снижаются, поскольку уменьшается вероятность операционной или статистической ошибки.
Подробное объяснение этой темы см. В следующем видео о слепой переоценке размера выборки:
Ничего не видно? Нажмите здесь, чтобы принять файлы cookie для воспроизведения видео
В. Что такое неслепая переоценка размера выборки?
При неслепой переоценке размера выборки размер выборки переоценивается при промежуточном анализе с использованием неслепых данных. Поскольку промежуточные данные не скрыты, промежуточный эффект известен, и это обычно цель для неслепого SSR.Несмотря на результаты предыдущих исследований, эффект лечения может иметь высокий уровень неопределенности на стадии проектирования, и, таким образом, размер промежуточного эффекта является очевидным показателем адаптации.
Поскольку раскрытие слепых данных создает значительные риски статистической и операционной систематической ошибки, неслепая переоценка размера выборки обычно выполняется в контексте, когда неслепой адаптивный дизайн уже запланирован, например, дизайн с использованием обычного группового последовательного дизайна. Из-за этого наиболее распространенные неслепые конструкции SSR — это расширения к групповой последовательной схеме, которые добавляют возможность увеличения размера выборки в дополнение к опции ранней остановки.
Наиболее распространенная неслепая структура SSR предполагает дизайн, который изначально обеспечивает более оптимистичный размер эффекта, но допускает увеличение размера выборки для размеров промежуточного эффекта, которые меньше оптимистичного размера эффекта, но которые все еще являются «многообещающими» для меньшего, но все же клинически значимого разница. По этой причине такие конструкции часто называют конструкциями «перспективной зоны».
Чтобы оценить, является ли промежуточный результат «многообещающим», наиболее распространенным показателем является условная мощность.Однако некоторые предложили альтернативные показатели, такие как предсказательная сила, из-за сильных допущений относительно «истинного» размера эффекта при расчетах условной мощности.
Подробное объяснение этой темы см. В следующем видео о повторной оценке размера выборки без слепого обзора:
Ничего не отображается? Нажмите здесь, чтобы принять файлы cookie для воспроизведения видео
Условная мощность — это вероятность того, что испытание отклонит нулевую гипотезу при последующем рассмотрении с учетом текущей статистики теста и предполагаемых «истинных» значений параметров, которые обычно считаются равными их промежуточным оценкам или их начальным плановым значениям.
В. Что такое предсказательная сила?Прогностическая мощность (также известная как байесовская предсказательная сила) — это условная мощность, усредненная по апостериорному распределению величины эффекта. Обычно он используется для количественной оценки вероятности успеха клинического испытания. Он был предложен в качестве лучшей альтернативы условной мощности, поскольку он рассматривает «истинные» оценки как неопределенные, а не фиксированные.
Универсальное веб-приложение Angular со случайным медленным SSR (15 с на запрос)
Всем привет (@ 04821556, @ julian-7027, @ RemyVillain-8585, @ AlvinHo-0737 и другие, которые столкнулись с аналогичной проблемой),
Я отладил сообщенную проблему с универсальным веб-приложением Angular с SSR и отправкой HTTP-запросов, когда вы сообщили о случайной медлительности, и после тщательного тестирования мы определили, что проблема возникает только при использовании бескодовой интеграции аналитики приложений.
Причина в том, что для Nodejs SDK для Application Insights (при использовании SSR в Angular он используется по умолчанию) значение maxBatchIntervalMs по умолчанию указано как 15000 мс (15 секунд), если не указано другое значение. как показано ниже:
maxBatchIntervalMs: Максимальное время ожидания, в течение которого полезная нагрузка достигнет maxBatchSize (по умолчанию 15000 мс или 15 секунд).
Для получения дополнительной информации перейдите по следующей ссылке:
Узел монитора.js с помощью Azure Application Insights — Azure Monitor | Документы Microsoft
Итак, если размер полезной нагрузки не достигает maxBatchSize, HTTP-запросы блокируются для отправки в конечную точку телеметрии (Azure). Это вызывает периодические задержки.
Разрешение:
Проблема устранена после указания настраиваемого значения для maxBatchIntervalMs (пример 100 мс), как показано в примере кода ниже:
https: // github.com / shuanand / angularuniversalSSRApplicationInsight / blob / main / server.ts
Чтобы настроить то же самое, сначала отключите Application Insights на портале Azure веб-приложения после копирования ключа Instrumentation из панели мониторинга App Insights, щелкнув колонку Обзор, как показано ниже:
Затем вы можете обновить ключ инструментария для своего приложения в файле server.ts, как показано ниже:
appInsights.настройка («PLEASE_ENTER_YOUR_APPLICATION_INSIGHTS_INSTRUMENTATION_KEY_HERE»)
Как только это будет сделано, не будет случайной задержки даже после использования Application Insights, как показано ниже, и все показатели будут доступны на панели Application Insights Dashboard:
Универсальное приложение Angular, использующее запросы SSR и Http в службе приложений Linux:
angularssrdemo.azurewebsites.net
После внесения упомянутых изменений код работает и в службе приложений Windows и контейнеров.
Спасибо @ julian-7027 за то, что поделились образцом кода, чтобы быстро воспроизвести проблему.
Прокомментируйте, если вы все еще сталкиваетесь с проблемой с образцом кода, я проверю то же самое.
Кангана реагирует на «неофициальную утечку AIIMS» в деле SSR, требует ответов от «мафии кино»
Кангана Ранаут выступил против «неофициальной утечки» экспертной комиссии AIIMS в субботу, которая утверждала, что вероятной причиной смерти покойного актера Сушанта Сингха Раджпута является самоубийство.Она заявила в Твиттере, что такие выдающиеся личности, как Сушант, не убивают себя, а также заявила, что над ним «издевались», «изгоняли» и «преследовала» «кино-мафия». В то время как различные СМИ сообщали, что в отчете «окончательно» исключено убийство, официального заявления от AIIMS не поступало.
Актер Manikarnika также поставил под сомнение последнее обновление AIIMS и потребовал ответов по другим аспектам, включая профессиональное давление и силовую политику в киноиндустрии.Кангана до недавнего времени была единственной известной звездой Болливуда, которая повысила голос в поддержку покойного актера, утверждая, что он не мог покончить жизнь самоубийством. Она привела несколько причин, в том числе лоббизм и фаворитизм Болливуда, которые якобы могли причинить Сушанту душевную травму, приведшую к его трагическому концу.
Молодые и необычные люди не просыпаются в один прекрасный день и не убивают себя. Сушант сказал, что над ним издеваются и изгоем, он опасается за свою жизнь, он сказал, что мафия в кино запретила его и преследовала его, он был психически затронут ложным обвинением в изнасиловании #AIIMS
— Кангана Ранаут (@KanganaTeam) 3 октября 2020 г.
С учетом последних достижений нам нужны ответы на несколько вопросов.
— Кангана Ранаут (@KanganaTeam) 3 октября 2020 г.
1) ССР неоднократно говорила о запрете его крупными производственными домами. Кто эти люди, которые сговорились против него?
2) Почему СМИ распространяют ложные новости о том, что он насильник?
3) Почему Махеш Бхатт занимался психоанализом?
Читать | Кангана Ранаут утверждает, что «BMC угрожает сломать дома соседям, если они поддержат меня»
Сегодня утром различные СМИ сообщили, что специальная группа AIIMS, расследующая смерть Сушанта Сингха Раджпута, исключила убийство.Все эти отчеты якобы основывались на утечках средствам массовой информации судебно-медицинского эксперта доктора Судхира Гупты. Однако официального заявления от AIIMS не поступало. Кроме того, CBI заявил, что все окончательные выводы, представленные в отчете AIIMS, будут приняты как мнения, а не доказательства в их будущих действиях по делу о смерти Сушанта.
Читать | «NCB следует проверить, говорила ли Кангана, что она принимала наркотики», — говорит лидер BJP; Нагма повторяет
Доктор Судхир Гупта, руководитель группы криминалистической экспертизы AIIMS, сообщил ANI в субботу, что дело Сушанта связано с повешением и самоубийством.Он показал, что на теле актера не было обнаружено никаких травм, кроме следов от лигатуры на его шее, которые предположительно связаны с повешением. Он добавил, что в токсикологических отчетах также не было обнаружено никаких соблазнительных материалов.
Читать | Ранвир Шори спрашивает: «Почему люди пытаются закрыть Кангана Ранаут?»
Наследие Сушанта
Сушант Сингх Раджпут считался одной из самых успешных звезд своего возраста, пока не скончался 14 июня. За восемь лет карьеры он создал множество хитов, таких как MS Dhoni: The Untold Story, Chhichhore, Kai Po Che, Kedarnath , среди прочего, помимо признанных критиками ролей в таких фильмах, как Детектив Бёмкеш Бакши и Сончирия .Последний фильм SSR Dil Bechara оказался огромным успехом после того, как он был выпущен на потоковой платформе.
Читать | Кангана Ранаут радуется «особому дню», направляясь на юг для «амбициозного» проекта Thalaivi
Получите последние новости развлечений из Индии и всего мира. Теперь следите за вашими любимыми телевизионными знаменитостями и обновлениями телеканалов. Republic World — ваш универсальный пункт назначения новостей Болливуда .Подключайтесь сегодня, чтобы быть в курсе всех последних новостей и заголовков из мира развлечений.
Платформа для эффективного генотипирования Musa с использованием микросателлитных маркеров
Растения AoB. 2011; 2011: plr024.
Павла Кристелова
1 Центр биотехнологических и сельскохозяйственных исследований региона Гана, Институт экспериментальной ботаники, Sokolovská 6, Olomouc CZ-77200, Чешская Республика
Мирослав Валарик
1 Центр региона Биотехнологические и сельскохозяйственные исследования, Институт экспериментальной ботаники, Sokolovská 6, Olomouc CZ-77200, Чешская Республика
Eva Hřibová
1 Центр биотехнологических и сельскохозяйственных исследований региона Гана, Институт экспериментальной ботаники, Sokolovská 6, Olomouc CZ -77200, Чешская Республика
Инес Ван ден Хаув
2 Лаборатория по улучшению тропических культур, Католикский университет Лёвен, Kasteelpark Arenberg 13, B-3001 Leuven, Бельгия
Stéphanie Scandic Channelière
Agropolis II, Montpellier Cedex 5, 34397, Франция
Николя Ру 90 280
3 Bioversity International, Parc Scientifique Agropolis II, Montpellier Cedex 5, 34397, France
Jaroslav Doležel
1 Центр биотехнологических и сельскохозяйственных исследований в регионе Гана, Институт экспериментальной ботаники, Соколовска 6, Соколовска, 6, -77200, Чешская Республика
1 Центр биотехнологических и сельскохозяйственных исследований региона Гана, Институт экспериментальной ботаники, Sokolovská 6, Olomouc CZ-77200, Чешская Республика
2 Лаборатория улучшения тропических культур, Католикский университет Лёвена , Kasteelpark Arenberg 13, B-3001 Leuven, Бельгия
3 Bioversity International, Parc Scientifique Agropolis II, Montpellier Cedex 5, 34397, France
Получено 17 марта 2011 г .; Изменения запрошены 14 мая 2011 г .; Принята в печать 16 августа 2011 г.
Авторские права Опубликовано Oxford University Press Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/2.5/uk/), которая разрешает неограниченное неограниченное использование коммерческое использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы. Эта статья цитируется в других статьях PMC.Аннотация
Предпосылки и цели
Бананы и подорожники ( Musa spp.) являются одними из основных фруктовых культур во всем мире и имеют признанное значение в качестве основного продукта питания для миллионов людей. Однако богатому генетическому разнообразию этой культуры угрожают болезни, неблагоприятные условия окружающей среды и изменившиеся методы ведения сельского хозяйства, и необходимость ее характеристики и сохранения является насущной. С целью обеспечения простого и надежного подхода к молекулярной характеристике видов Musa мы разработали оптимизированную платформу для генотипирования с использованием 19 опубликованных простых маркеров повторов последовательности.
Методология
Система генотипирования основана на 19 микросателлитных локусах, которые оцениваются с использованием флуоресцентно меченных праймеров и разделения с помощью высокопроизводительного капиллярного электрофореза с высоким разрешением. Эта платформа генотипирования была протестирована и оптимизирована на наборе из 70 диплоидных и 38 триплоидных образцов бананов.
Основные результаты
Набор маркеров, использованный в этом исследовании, обеспечил достаточный полиморфизм, чтобы различать отдельные виды, подвиды и подгруппы всех образцов Musa .Аналогичным образом была подтверждена возможность выявления повторяющихся образцов. На основании результатов слепого теста подтверждена пригодность системы генотипирования для характеристики неизвестных образцов.
Выводы
Здесь мы сообщаем о первой сложной и стандартизированной платформе для молекулярной характеристики зародышевой плазмы Musa , которая готова к использованию для более широкого исследовательского и селекционного сообщества Musa . Мы считаем, что эта система генотипирования предлагает универсальный инструмент, который может удовлетворить все возможные требования для характеристики разнообразия Musa и является экономичным для образцов от одного до нескольких образцов.
Введение
Важная роль бананов и подорожников ( Musa spp.) Как одного из основных товаров мировой торговли и обеспечения продовольственной безопасности для миллионов людей, особенно во влажных тропиках, неоспорима. Однако эта культура подвергается серьезной опасности со стороны многочисленных вредителей и болезней. Селекционным усилиям препятствует высокая степень стерильности бананов и отсутствие охарактеризованной зародышевой плазмы как потенциальных родителей для селекции. Выращиваемые в настоящее время сорта бананов в основном представляют собой триплоидные клоны, которые произошли от внутривидовых гибридов Musa acuminata и межвидовых гибридов между M.acuminata и Musa balbisiana , с возможным участием нескольких других видов этого рода. Чтобы разработать эффективную стратегию выведения улучшенных сортов бананов и поддержать выбор родителей для скрещивания, необходимо твердое понимание генетического разнообразия доступных ресурсов. Аналогичным образом, сохранение существующих генных ресурсов имеет важное значение, особенно когда мы наблюдаем постоянную утрату разнообразия бананов из-за неделикатного обращения с окружающей средой в тропических лесах, а также из-за изменения методов ведения сельского хозяйства мелких землевладельцев.Основные цели и средства сохранения разнообразия Musa были сформулированы в Глобальной стратегии сохранения Musa (INIBAP 2006) в рамках GMGC (Глобальный консорциум геномики Musa). Тем не менее, независимо от выбранной стратегии, эффективный сбор и сохранение разнообразия бананов во многом зависят от однозначной идентификации образцов. Чтобы избежать проблем с дублированием в национальных, региональных и глобальных коллекциях зародышевой плазмы, большое преимущество будет иметь точная и стандартизованная характеристика вновь введенных образцов, а также тех, которые уже хранятся в генных банках.Эти усилия по рационализации позволят эффективно сохранить образцы Musa .
Традиционная классификация видов Musa основана на морфологических признаках и количестве хромосом (основное число хромосом; x ) (Cheesman 1947; Simmonds and Shepherd 1955). Хотя морфотаксономическая система позволяет дифференцировать определенные клоны бананов (Stover and Simmonds 1987), недостатки этого подхода начинают проявляться по мере того, как генетическая основа изучаемых растений сужается.Кроме того, небольшое изменение на уровне ДНК может вызвать большое фенотипическое проявление, в то время как иногда после обширных генетических изменений могут наблюдаться незначительные морфологические изменения или их отсутствие. Очевидно, что классификационная система, основанная исключительно на фенотипических проявлениях генома, страдает ограниченной точностью (Crouch et al. 2000; De Langhe et al. 2005), но ее можно сделать надежной, если она подкреплена характеристикой на молекулярной основе. .
Огромное увеличение доступности различных молекулярных методов за последние десятилетия облегчило классификацию новых сортов бананов, а также переоценку традиционной таксономии.Среди широкого набора молекулярных инструментов некоторые маркеры привлекли особое внимание с точки зрения их использования в исследованиях разнообразия и молекулярной характеристики генотипов бананов. Совсем недавно технология массивов разнообразия использовалась для оценки генетического разнообразия видов Musa spp. (Risterucci и др. 2009). Обладая преимуществом высокопроизводительного подхода, подходящего для большого количества генотипов, его использование для ограниченного количества образцов за короткий период времени на оборачиваемость поставило бы его в ряд более требовательных методов с точки зрения финансовой поддержки.То же самое относится к подходу генотипирования путем секвенирования, которому в последнее время уделяется особое внимание (Elshire et al. 2011). Другими молекулярными маркерами, использованными в исследованиях разнообразия Musa , были RAPD (случайная амплифицированная полиморфная ДНК; Pillay et al. 2000, 2001; Ruangsuttapha et al. 2007; Venkatachalam et al. 2008) и AFLP (длина амплифицированного фрагмента полиморфизмы; Loh et al. 2000; Wong et al. 2001 a ; Ude et al .2002; Wang et al. 2007). Оба этих маркера имеют относительно высокий уровень полиморфизма, но они являются доминирующими, и в случае RAPD их воспроизводимость является серьезным ограничением (Jones et al. 1997). Для Musa также использовались более выгодные кодоминантные маркеры, такие как RFLP (полиморфизмы длины рестрикционных фрагментов; Gawel et al. 1992; Nwakanma et al. 2003; Ning et al. 2007) и SSR. (повторяется простая последовательность; e.грамм. Kaemmer et al. 1997; Grapin et al. 1998; Lagoda et al. 1998; Buhariwalla et al. 2005). Хотя RFLP хорошо работают с точки зрения воспроизводимости, они имеют относительно низкий уровень полиморфизма и их трудно использовать. Напротив, маркеры SSR превосходят RFLP и RAPD во всех вышеупомянутых аспектах.
Микросателлиты (SSR) представляют собой отрезки простых повторяющихся мотивов длиной от 1 до 6 пар оснований, расположенных тандемно в геномах прокариотических и эукариотических организмов.Их фланкирующие области, которые обычно высококонсервативны, подходят для конструирования локус-специфичных праймеров. Простые повторы последовательностей успешно применялись при молекулярном генотипировании многих важных сельскохозяйственных культур, таких как рис (Pessoa-Filho et al. 2007), злаки (Hayden et al. 2007), виноград (This et al. 2004). ) или какао (Zhang et al. 2006). Кроме того, использование маркеров SSR открывает возможность автоматизации и мультиплексирования, что значительно увеличивает пропускную способность метода.
С целью разработки стандартизированного протокола для классификации зародышевой плазмы Musa мы протестировали и оптимизировали использование 22 опубликованных маркеров SSR на наборе генотипов бананов. Целью настоящего исследования было изучить потенциал этого набора маркеров для различения индивидуальных образцов и разработать стандартизированную процедуру генотипирования Musa , которая могла бы служить основой для молекулярной характеристики новых образцов, введенных в глобальный ген Musa . bank (Международный транзитный центр (ITC), Лёвен, Бельгия), а также более широкому сообществу исследователей и селекционеров Musa .
Материалы и методы
Растительный материал и коллекция эталонной ДНК
Коллекция эталонной ДНК, включающая в общей сложности 65 образцов [дополнительная информация 1], была создана для представления генетического разнообразия в пределах рода Musa. In vitro проростков этих образцов доступны для распространения от Bioversity ITC. Геномная ДНК 61 из 65 образцов хранится в Центре ресурсов генома (http://www.musagenomics.org/cetest_firstpage1/genomic_dna.html) и доступен для распространения. Из 65 образцов 54 были успешно включены в анализ [Дополнительная информация 1]. Чтобы расширить диплоидное представление набора генотипов, было включено 39 дополнительных диплоидных образцов [Дополнительная информация 2], при этом три из них являются дубликатами образцов в коллекции эталонной ДНК. Эти дубликаты были включены намеренно, чтобы проверить способность платформы генотипирования идентифицировать дубликаты образцов. Все 39 дополнительных диплоидных образцов происходили из коллекции ITC (Лёвен, Бельгия) как укоренившихся in vitro растений и содержались в отапливаемой теплице после переноса в почву.ДНК этих 39 записей была выделена из молодой ткани листа с использованием набора Invisorb ® Spin Plant Mini (Invitek, Берлин, Германия), следуя инструкциям производителя.
Амплификация полимеразной цепной реакции и анализ фрагментов
22 SSR локуса (таблица) были амплифицированы с использованием специфических праймеров (Crouch et al. 1998; Lagoda et al. 1998; Hippolyte et al. 2010), которые были с поправкой на хвосты 5′-M13, чтобы можно было использовать универсальный флуоресцентно меченый праймер согласно Schuelke (2000).Для мечения праймеров использовали четыре разных флуофоров [6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM), VIC, NED и PET; Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США], с учетом последующего мультиплексирования реакций (таблица). Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 10 нг матричной геномной ДНК, реакционный буфер (состоящий из 10 мМ Tris – HCl (pH 8), 50 мМ KCl, 0,1% Triton-X100 и 1,5 мМ MgCl 2 ), 200 мкМ dNTP (каждый), 1 ед. Полимеразы Taq , 8 пмоль локус-специфичного прямого праймера M13, 6 пмоль флуоресцентно меченного универсального прямого праймера M13 и 10 пмоль локус-специфичного обратного праймера .Условия цикла были установлены следующим образом: начальная стадия денатурации при 94 ° C в течение 5 мин, затем 35 циклов денатурации (94 ° C / 45 с), отжиг при температуре, соответствующей локус-специфическому праймеру (1 мин) и удлинение (72 ° C / 1 мин). Окончательное удлинение давали в течение 5 минут при 72 ° C. Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) очищали осаждением этанолом / ацетатом натрия. Для повышения точности биннинга аллелей были выполнены три независимые реакции ПЦР.
Таблица 1
Подробный список маркеров SSR, использованных в исследовании.
| Маркер | Флуорофор | Мотив | Ссылка | Образец GenBank | Температура отжига (это исследование; ° C) | Минимальный аллель (это исследование; п.н.) | аллель |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| mMaCIR01 | 6-FAM | (GA) 20 | Lagoda et al . (1998) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «X87262», «term_id»: «854253», «term_text»: «X87262»}} X87262 | 55 | 241 | 440 |
| mMaCIR03 | 6-FAM | (GA) 10 | Lagoda et al .(1998) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «X87263», «term_id»: «854255», «term_text»: «X87263»}} X87263 | 55 | 111 | 147 |
| mMaCIR07 | NED | (GA) 13 | Lagoda et al . (1998) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «X87258», «term_id»: «854258», «term_text»: «X87258»}} X87258 | 53 | 136 | 195 |
| mMaCIR08 | VIC | (TC) 6N24 (TC) 7 | Lagoda et al .(1998) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «X87264», «term_id»: «854254», «term_text»: «X87264»}} X87264 | 55 | 229 | 283 |
| mMaCIR13 | PET | (GA) 16N76 (GA) 8 | Lagoda et al . (1998) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «X | «, «term_id»: «971501», «term_text»: «X«}} X53 | 268 | 427 |
| mMaCIR24 | PET | (TC) 7 | Lagoda et al .(1998) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «Z85972», «term_id»: «2266708», «term_text»: «Z85972»}} Z85972 | 48 | 240 | 291 |
| mMaCIR27 a | PET | (GA) 9 | Lagoda et al . (1998) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «Z85962», «term_id»: «2266698», «term_text»: «Z85962»}} Z85962 | 58 | 232 | 277 |
| mMaCIR39 | VIC | (CA) 5GATA (GA) 5 | Lagoda et al .(1998) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «Z85970», «term_id»: «2266706», «term_text»: «Z85970»}} Z85970 | 52 | 329 | 390 |
| mMaCIR40 | 6-FAM | (GA) 13 | Lagoda et al . (1998) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «Z85977», «term_id»: «2266712», «term_text»: «Z85977»}} Z85977 | 54 | 169 | 247 |
| mMaCIR45 | 6-FAM | (TA) 4CA (CTCGA) 4 | Lagoda et al .(1998) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «Z85968», «term_id»: «2266704», «term_text»: «Z85968»}} Z85968 | 57 | 274 | 318 |
| mMaCIR150 | VIC | (CA) 10 | Hippolyte et al . (2010) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «AM950440», «term_id»: «193227625», «term_text»: «AM950440»}} AM950440 | 54 | 253 | 376 |
| mMaCIR152 | 6-FAM | (CTT) 18, (CT) 17, (CA) 6 | Hippolyte et al .(2010) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «AM950442», «term_id»: «193227627», «term_text»: «AM950442»}} AM950442 | 54 | 147 | 195 |
| mMaCIR164 | VIC | (AC) 14 | Hippolyte et al . (2010) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «AM950454», «term_id»: «193227639», «term_text»: «AM950454»}} AM950454 | 55 | 256 | 458 |
| mMaCIR195 a | VIC | (GA) 11, (GA) 6 | Hippolyte et al .(2010) | {«type»: «entrez-nucleotide», «attrs»: {«text»: «AM950461», «term_id»: «193227646», «term_text»: «AM950461»}} AM950461 | 54 | 262 | 306 |
| mMaCIR196 | NED | (TA) 4, (TC) 17, (TC) 3 | Hippolyte et al . (2010) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «AM950462», «term_id»: «193227647», «term_text»: «AM950462»}} AM950462 | 55 | 163 | 201 |
| mMaCIR214 | NED | (AC) 7 | Hippolyte et al .(2010) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «AM950480», «term_id»: «193227665», «term_text»: «AM950480»}} AM950480 | 53 | 115 | 238 |
| mMaCIR231 | NED | (TC) 10 | Hippolyte et al . (2010) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «AM950497», «term_id»: «193227682», «term_text»: «AM950497»}} AM950497 | 55 | 236 | 286 |
| mMaCIR260 | PET | (TG) 8 | Hippolyte et al .(2010) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «AM950515», «term_id»: «193227700», «term_text»: «AM950515»}} AM950515 | 55 | 204 | 264 |
| mMaCIR264 | 6-FAM | (CT) 17 | Hippolyte et al . (2010) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «AM950519», «term_id»: «193227704», «term_text»: «AM950519»}} AM950519 | 53 | 234 | 383 |
| mMaCIR307 | NED | (CA) 6 | Hippolyte et al .(2010) | {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «AM950533», «term_id»: «193227718», «term_text»: «AM950533»}} AM950533 | 54 | 143 | 173 |
| Ma-1-32 a | NED | (GA) 17AA (GA) 8AA (GA) 2 | Crouch et al . (1998) | нет данных | 58 | 208 | 251 |
| Ma-3-90 | PET | (CT) 11 | Crouch et al .(1998) | нет данных | 53 | 147 | 191 |
Для автоматического капиллярного электрофореза оптимизированные количества продуктов амплификации были объединены с высоко деионизированным формамидом и внутренним стандартом (GeneScan TM -500 LIZ size стандарт; Прикладные биосистемы). После 5-минутной денатурации при 95 ° C образцы были загружены в автоматический 96-капиллярный анализатор ДНК ABI 3730xl, и электрофоретическое разделение и обнаружение сигнала были выполнены с настройками модуля по умолчанию.Чтобы снизить стоимость и увеличить емкость платформы для генотипирования, образцы были мультиплексированы для второго и третьего раундов электрофоретического разделения. Применялось до 4-кратное мультиплексирование путем объединения четырех продуктов ПЦР, меченных различными флуоресцентными красителями (6-FAM, VIC, NED и PET; таблица), в один образец для загрузки. Уровень мультиплексирования может быть дополнительно увеличен путем комбинирования продуктов различной ожидаемой длины, меченных одинаковыми флуоресцентными красителями.
Определение размера фрагментов и анализ данных
Полученные данные анализировали с помощью GeneMarker ® v1.75 (Softgenetics, LLC, Государственный колледж, Пенсильвания, США). Автоматическая оценка данных сопровождалась тщательной ручной проверкой, и образцы ДНК низкого качества были исключены из анализа. Панели маркеров были построены на основе вызовов аллелей набора образцов коллекции референсной ДНК и позже расширены дополнительными вызовами диплоидных аллелей присоединения, чтобы увеличить базу данных референсных SSR-профилей. Бины для каждого аллеля были установлены относительно частот аллелей и силы сигнала, извлеченных из трех повторных прогонов каждого образца.
Диплоидные и триплоидные образцы были проанализированы отдельно, поскольку в случае полиплоидных видов полисомное наследование приводит к одновременному появлению нескольких аллелей одного SSR. В такой ситуации невозможно определить точное количество копий отдельных аллелей; поэтому генотипические данные преобразуются в двоичные данные (кодируются 1 — присутствие / 0 — отсутствие) и анализируются как запись доминантного маркера (Weising et al. 2005). Как генотипические, так и бинарные данные использовались для создания матриц генетического сходства на основе коэффициента генетической дистанции Нея (Nei, 1973) в программном обеспечении PowerMarker v3.25 (Лю и Муза, 2005). Невзвешенный парно-групповой метод со средним арифметическим (UPGMA; Michener and Sokal 1957) использовался для оценки взаимосвязи между отдельными генотипами. Результаты кластерного анализа UPGMA были визуализированы в виде дерева с помощью TreeView v1.6.6 (стр. 1996). Информацию о полиморфизме (PIC) и гетерозиготность отдельных маркеров оценивали в PowerMarker v3.25. Общая вероятность идентичности ( P ID ) неродственных мультилокусных генотипов оценивалась согласно Paetkau et al. (1995), как это реализовано в программе IDENTITY (Wagner and Sefc 1999).
Слепой тест
Чтобы проверить надежность оптимизированной платформы генотипирования и ее потенциал в качестве стандартизированной методологии для молекулярной характеристики новых образцов, был проанализирован набор анонимных образцов [Дополнительная информация 3]. Геномную ДНК экстрагировали из лиофилизированной ткани листа, предоставленной ITC, и образцы анализировали в соответствии с той же экспериментальной процедурой, что и для контрольной коллекции ДНК.Отрицательный и положительный контроли (пять ранее проанализированных эталонных генотипов) были включены в слепой тест для обеспечения правильного определения размера аллелей и контроля стабильности электрофоретического состояния. Неизвестные образцы были закодированы численно, и их истинная личность была раскрыта нашими партнерами только после анализа данных. Как выяснилось впоследствии, набор слепых тестовых образцов содержал еще четыре образца, которые были дубликатами эталонной коллекции ДНК [см. Дополнительную информацию 1 и 3].
Обработка ошибок генотипирования
Чтобы устранить ошибки генотипирования, в процессе генотипирования были приняты несколько мер предосторожности, следуя рекомендациям Bonin et al. (2004). Во-первых, чтобы минимизировать эффект выпадения аллелей, был использован подход с несколькими пробирками (Taberlet et al. 1996) с тремя независимыми реакциями для каждой комбинации маркера / генотипа. Подверженные ошибкам образцы с ДНК низкого качества были исключены из анализа. Во-вторых, был исследован мультилокусный генотип, и образцы, различающиеся в одном локусе, были тщательно проверены и повторно проанализированы (при необходимости) для подтверждения различия.В-третьих, чтобы уменьшить количество ошибок, связанных с человеческим фактором, подготовка образцов для воспроизводимых реакций выполнялась двумя разными людьми. Оценка данных проводилась по строго заранее установленным параметрам, чтобы избежать таких ошибок, как неправильная интерпретация пиков заикания.
Результаты
Двадцать два маркера SSR были выбраны CIRAD в качестве набора, позволяющего различать людей в коллекции эталонной ДНК Musa (Crouch et al. 1998; Lagoda et al. 1998; Hippolyte и другие. 2010; Сайт 1; Стол ). После первоначального двойного повторения скрининга праймеров с использованием нашего протокола было выбрано 19 маркеров из начального набора 22 маркеров для их четкого воспроизводимого паттерна амплификации. Три маркера, которые были исключены из анализа, вызвали сильное заикание пиков, что сделало невозможным воспроизводимую интерпретацию профилей SSR. Все дальнейшие анализы проводились с выбранными 19 SSR. Всего профили SSR были собраны для 70 диплоидных и 38 триплоидных образцов бананов.Вся необходимая информация о методологии генотипирования, а также полные файлы оценок аллелей для проанализированных генотипов также доступны в Интернете по адресу http://olomouc.ueb.cas.cz/musa-genotyping-centre.
Анализ диплоидных образцов
Диплоидные образцы были недостаточно представлены в эталонной коллекции ДНК; поэтому мы решили включить в анализ дополнительные диплоиды, чтобы увеличить количество эталонных профилей SSR [Дополнительная информация 2]. В результирующем наборе из 70 диплоидных образцов (включая записи слепого теста) всего 292 аллеля были оценены из 19 локусов, в среднем 15.4 аллеля на локус. Наблюдаемая гетерозиготность (доля всех лиц, гетерозиготных по наблюдаемому локусу) варьировала от 0,179 до 0,714 (в среднем 0,450). PIC используемых маркеров был относительно высоким (в среднем 0,827), в диапазоне от 0,625 до 0,936 (подробности см. В таблице). P ID (объединенный по всем локусам), который представляет вероятность чисто случайного наблюдения идентичных генотипов, был 9,44 × 10 -29 , что указывает на чрезвычайно высокую разрешающую способность этого набора маркеров.
Таблица 2
Номер аллеля, частота основного аллеля, наблюдаемые уникальные генотипы, гетерозиготность и информативность (PIC) 19 микросателлитных локусов, примененных к набору данных из 70 диплоидных образцов Musa.
| Маркер | Частота основного аллеля | Количество наблюдаемых уникальных генотипов | Номер аллеля | Наблюдаемая гетерозиготность | PIC a | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 5 | 39 | 26 | 0,531 | 0,936 | ||||||
| мMaCIR03 | 0,357 | 13 | 7 | 0,400 | 0,694 | 0,694 | 0,883 | |||
| мMaCIR08 | 0,231 | 22 | 12 | 0,646 | 0,830 | |||||
| мMaCIR13 | 0,210 19 | 905 0 5113 | 0,870 | |||||||
| мMaCIR24 | 0,328 | 19 | 15 | 0,344 | 0,767 | |||||
| мMaCIR39 | 010,200 9011 | 010 905 905 | 0,233 | 29 | 23 | 0,534 | 0,887 | |||
| мMaCIR45 | 0,207 | 16 | 8 | 0,357 | 0.801 | |||||
| мMaCIR150 | 0,328 | 20 | 15 | 0,522 | 0,797 | |||||
| мMaCIR152 | 0,232 | 19 | 0,232 | 19 905 | 28 | 22 | 0,322 | 0,916 | ||
| мMaCIR196 | 0,250 | 23 | 13 | 0,453 | 0.855 | |||||
| мMaCIR214 | 0,383 | 12 | 7 | 0,313 | 0,670 | |||||
| мMaCIR231 | 0,214 | 14 | 0,214 | 14905 | 20 | 14 | 0,357 | 0,765 | ||
| мMaCIR264 | 0,239 | 35 | 24 | 0,522 | 0.900 | |||||
| мMaCIR307 | 0,500 | 10 | 6 | 0,179 | 0,625 | |||||
| Ма-3-90 | 0,167 | 31 | 0,167 | 31 | 0,258 | 24,4 | 15,4 | 0,450 | 0,827 |
Кластерный анализ UPGMA, основанный на генетической дистанции Нея (1973), выявил относительно четкую группировку групп и подгрупп генотипов (рис.). Представители B-генома M. balbisiana , включая диплоидные гибридные сорта (AB и BB × T), образовали отдельный кластер (кластер I). Представители А-генома видов M. acuminata сгруппированы в несколько кластеров в зависимости от их подвидовой классификации. Musa acuminata ssp. Banksii записей, сгруппированных в кластер II, M. acuminata ssp. microcarpa сгруппированы вместе с Musa schizocarpa и гибридами AS в кластере III.Единственный представитель подвида errans , сорт Agutay, присутствовал в отдельной кладе, связанной с описанными выше кластерами M. acuminata . Подкластер VI содержал M. acuminata ssp. зебрина представителей. Подвиды burmannica , burmannicoides и siamea были сгруппированы в кластере VII, разделяя свое положение с несколькими объектами из секции Rhodochlamys. M usa acuminata ssp.Подвид malaccensis образуют отдельный кластер, обозначенный VIII (рис.). Большинство сортов AA были сгруппированы в кластер IV. Представители секции Australimusa, включенные в исследование, сформировали кластер V вместе с Musa Beckcarii (отнесены к секции Callimusa). Musa coccinea , другой представитель секции Callimusa, был отделен от всех остальных групп, что напомнило поведение особей чужой группы. Как упоминалось ранее, виды Rhodochlamys частично присутствовали в кластере VII (в частности, записи Musa ornata и Musa mannii ). Musa velutina образцов, еще один представитель секции Rhodochlamys, образовали отдельный кластер, обозначенный как IX, вместе с единственным образцом M. ornata (ITC 1330).
Дендрограмма, показывающая результаты анализа UPGMA набора данных диплоидных образцов. Значения поддержки Bootstrap выше 50% отмечены под соответствующими ветвями. Классификация генотипов на отдельные секции, виды и подвиды рода Musa обозначена цветными боковыми полосами и легендами.Полный список образцов с их таксономической информацией можно найти в [Дополнительная информация 1 и 2].
Слепой тест с диплоидными образцами
Когда анонимные образцы были включены в набор данных, кластеризация была немного изменена (рис.). Позиция образца Agutay ( M. acuminata, ssp. errans ) переместилась в кластер II, содержащий в основном M. acuminata ssp. банковii записей. Еще одно изменение можно увидеть в позиции M.acuminata ssp. zebrina видов, которые больше не образуют отдельный субклад (ранее обозначенный как VI), а вместо этого сгруппированы в кластере IV, содержащем сорта AA. Наконец, кластер VII, хотя и не изменился по содержанию, теперь показал другой паттерн субкластеризации с M. acuminata ssp. burmannica , burmannicoides и siamea видов, сгруппированных вместе в один подкластер (VIIa), отделенный от записей Rhodochlamys (подкластер VIIb).
Дендрограмма, показывающая результаты анализа UPGMA набора данных диплоидных образцов, включая слепые тестовые образцы. Значения поддержки Bootstrap выше 50% отмечены под соответствующими ветвями. Анонимные образцы, включенные в слепой тест, выделены красным. Классификация генотипов на отдельные секции, виды и подвиды рода Musa обозначена цветными боковыми полосами и легендами. Полный список образцов с их таксономическими данными можно найти в [Дополнительная информация 1, 2 и 3].
Из девяти анонимных образцов восемь были правильно оценены как виды, наиболее близкие к соответствующему референтному образцу (рис.). Единственным исключением был слепой образец №2. 4 ( M. acuminata ssp. malaccensis ITC 0250), которые не группировались вместе со своим эталонным генотипом (тот же образец ITC 0250), а вместо этого сгруппировались вместе в пределах M. acuminata ssp. Banksii подгруппа (клада II). Мультилокусных генотипов слепой выборки нет.4 (ITC 0250) и ближайший родственный генотип Higa (ITC 0428) различались только по одному локусу, что позволяет предположить, что в слепом образце нет. 4 с большой долей вероятности принадлежали к подвидам bankii .
Для дальнейшего исследования этого несоответствия в результатах слепого теста мы провели анализ последовательности локуса внутреннего транскрибированного спейсера (ITS) в соответствии с Hřibová et al. (2011) у проблемных malaccensis образцов. Этот анализ подтвердил, что слепого образца нет.4 не был идентичен генотипу M. acuminata ssp. malaccensis ITC 0250, который был первоначально получен от ITC и хранился в местной теплице [см. Дополнительную информацию 4]. Однако результаты не являются окончательными в отношении идентичности слепого образца №. 4, поскольку только один представитель подвида Banksii использовался для анализа ITS в нашем предыдущем исследовании. Таким образом, нельзя прямо сказать, нет ли слепой выборки. 4 — другой генотип M.acuminata ssp. malaccensis или ssp. Banksii , точнее гибрид между подвидами malaccensis и Banksii . Только более подробный анализ последовательности, вероятно, даст однозначный ответ.
Анализ триплоидных образцов
Всего было проанализировано 38 триплоидных образцов (включая слепые тестовые записи). 19 микросателлитных локусов набрали в общей сложности 267 аллелей, в диапазоне от 8 до 24 на локус, со средним значением 14 аллелей на локус.Среднее значение PIC SSR-маркеров, примененных к триплоидным образцам, составило 0,850 (таблица).
Таблица 3
Частота основных аллелей, количество аллелей и информативность (PIC) 19 микросателлитных локусов, примененных к набору данных из 38 триплоидных образцов Musa.
| Маркер | Частота мажорного аллеля | Номер аллеля | PIC | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| mMaCIR01 | 0.105 | 24 | 6 0.942 | 0,942 | 712 | 0,839 |
| мMaCIR07 | 0,132 | 17 | 0,912 | |||
| мMaCIR08 | 0,237 | 12508 | 0,237 | 1250 905 905 9011 9011 9011 | 905 | |
| мMaCIR24 | 0,289 | 12 | 0,817 | |||
| мMaCIR39 | 0,316 | 18 | 0,859 | |||
| 289 | 9 | 0,817 | ||||
| мMaCIR45 | 0,289 | 12 | 0,814 | |||
| мMaCIR150 | 0,263 | 8 | 0,263 | 8 | 905||
| мMaCIR164 | 0,131 | 18 | 0,913 | |||
| мMaCIR196 | 0,237 | 15 | 0,881 | |||
| мМА263 | 8 | 0,788 | ||||
| мMaCIR231 | 0,132 | 16 | 0,905 | |||
| мMaCIR260 | 0,474 | 905 0,99|||||
| mMaCIR307 | 0,342 | 8 | 0,760 | |||
| Ma-3-90 | 0,105 | 21 | 0,934 | |||
| Среднее значение | 24214,1 | 0,850 |
Консенсусное дерево правил большинства анализа UPGMA показало два основных кластера: кластер A и кластер B (рис.). Кластер A содержал только образцы гибридов AAA с отдельной кладой, несущей представителей подгруппы Lujugira / Mutika, а также отдельной кладой, ведущей к съедобным видам из подгрупп Кавендиш и Грос-Мишель. Среди всех записей AAA, включенных в анализ, только образец Pisang Berangan оказался в кластере за пределами кластера A, разделяя кладу (IVa) с представителями африканского подорожника в основном кластере B.Второй основной кластер B был разделен на четыре подкластера / субклада. В то время как подкластер II был сформирован исключительно из гибридных записей AAB, подкластер I также содержал генотип ABB Namwa Khom (подгруппа Pisang Awak) как ближайший родственник образца AAB Figue Pomme Géante из подгруппы Silk. Два представителя гибридов ABB, Kluai Tiparot и Pelipita, сформировали третий субклад в кластере B (III). Большинство гибридов ABB были сгруппированы под IVb вместе с образцом AAB Popoulou.Африканские подорожники сформировали отдельную кладу IVa с одним представителем AAA P. Berangan, как упоминалось выше.
Дендрограмма, показывающая результаты анализа UPGMA набора данных триплоидных образцов. Значения поддержки Bootstrap выше 50% отмечены под соответствующими ветвями. Полный список образцов с их таксономической информацией можно найти в [Дополнительная информация 1 и 2].
Слепой тест с триплоидными образцами
Шесть закодированных триплоидных образцов были включены в слепой тест, и все они были правильно оценены как наиболее близкие родственные виды соответствующему эталонному генотипу из идентичных подгрупп со значительной статистической поддержкой (рис.). Положение некоторых клад немного изменилось после включения в анализ анонимных выборок (рис.). В частности, кластерный анализ UPGMA теперь показал измененное положение клады, ранее обозначенной III (образцы ABB Pelipita и Kluai Tiparot), и субклада кластера, ранее обозначенного II, несущего генотипы AAB P. Palembang, P. Rajah и P. Раджа Булу. Однако статистическая поддержка начальной загрузки для узлов, ведущих к этим кладам, не была значительно сильной ни в одном наборе данных, а положение всех других клад в дереве консенсуса осталось неизменным.
Дендрограмма, показывающая результаты анализа UPGMA набора данных триплоидных образцов, включая слепые тестовые образцы. Значения поддержки Bootstrap выше 50% отмечены под соответствующими ветвями. Анонимные образцы, включенные в слепой тест, выделены красным. Полный список образцов с их таксономическими данными можно найти в [Дополнительная информация 1, 2 и 3].
Идентификация повторяющихся образцов
Стопроцентное сходство мультилокусных генотипов было обнаружено в девяти парах повторяющихся образцов [дополнительная информация 5].Некоторые из дубликатов были намеренно внесены в набор образцов из местной теплицы (первоначально из коллекции ITC), чтобы оценить способность нашей системы генотипирования обнаруживать повторяющиеся образцы. Другие были введены через слепые тестовые образцы (см. Материалы и методы). Все дубликаты были идентифицированы [Дополнительная информация 5], за двумя исключениями. Образец ДНК из эталонной коллекции Musa textilis (ссылка 50), который, как сообщалось, соответствует номеру ITC ITC 1072, был идентичен другому M.textilis присоединение (ITC 0539). Это говорит о том, что эталонный образец (ссылка 50) был неправильно маркирован или его происхождение было указано неверно.
Еще одним ожидаемым дубликатом, введенным в триплоидные записи посредством слепого теста, был слепой образец 12 (Pisang Bakar ITC 1064). Соответствующий эталонный образец ДНК был исх. 19. Однако их идентичность, основанная на мультилокусном молекулярном профиле, не была подтверждена. Хотя эти две выборки различались по 7 из 19 локусов SSR, их наиболее близкое родство было выявлено после кластерного анализа UPGMA (рис.), предполагая, что их взаимная классификация подгрупп (subgr. Ambon) может быть правильной, но идентичность одного из образцов была запутана.
Более того, сообщалось о более чем одном повторном присоединении для обоих исх. 8 ( M. acuminata ssp. burmannicoides ‘Calcutta4’) и исх. 21 ( M. balbisiana ‘Tani’). Второй дубликат для каждого из двух эталонных образцов был отнесен к одному и тому же виду / подвиду [Дополнительная информация 5]. Это указывает на то, что либо использованный набор маркеров не обладал достаточной разрешающей способностью для различения этих образцов, либо, что более вероятно, на основании низкого значения P ID , упомянутого выше, эти образцы были неправильно маркированы.
Обсуждение
Хотя использование микросателлитных маркеров для анализа генетического разнообразия среди видов Musa хорошо задокументировано (например, Kaemmer et al. 1997; Grapin et al. 1998; Buhariwalla et al. 2005; Ning) et al. 2007; Venkatachalam et al. 2008; Wang et al. 2010), его применение в виде стандартизированной платформы для целей генотипирования для более широкого сообщества Musa все еще отсутствует.В этом исследовании мы попытались разработать оптимизированную систему на основе SSR для молекулярной характеристики образцов Musa , которую можно было бы использовать в качестве основы для создания Центра генотипирования Musa (MGC).
Неправильная маркировка образцов и дублирование образцов — распространенные проблемы в коллекциях зародышевой плазмы (например, Virk et al. 1995; Zhang et al. 2006). Разрешение набора маркеров, протестированного в этом исследовании, было достаточно высоким ( P ID = 9.44 × 10 –29 ), чтобы различать разные образцы, и оказался достаточно мощным для идентификации неправильно маркированных образцов, как это было задокументировано в случае M. acuminata ssp. malaccensis образец. Точно так же его потенциал для выявления дубликатов был четко доказан на настоящем наборе данных. Тем не менее, мы хотели обеспечить воспроизводимость результатов и минимизировать ошибки генотипирования до его внедрения на практике. По сравнению с исходными данными Lagoda et al. (1998) для подмножества маркеров диапазоны размеров аллелей перекрывались, но не идентичны. Подобные проблемы были описаны ранее, и чаще всего они были связаны с используемым методом и условиями электрофоретического разделения (например, Testolin et al. 2000; Creste et al. 2003). Кроме того, автоматическая система капиллярного электрофореза, используемая в этом эксперименте, обеспечивает гораздо более высокое разрешение и точность от серии к серии, чем ранее использовавшиеся системы на гелевой основе.Следовательно, более широкий диапазон размеров аллелей и большее количество идентифицированных аллелей увеличивает разрешающую способность набора маркеров, а не ограничивает возможности платформы.
Среди распространенных ошибок генотипирования, ответственных за неправильную идентификацию конкретного генотипа, важную роль играют выпадение аллелей и амплификация ложных аллелей. Выпадение аллеля — это случайная неспособность ПЦР амплифицировать один из аллелей, присутствующих в гетерозиготном локусе, что приводит к ложным гомозиготным паттернам (Pompanon et al. 2005). Для решения этой проблемы было предложено три варианта. Первый основан на систематической репликации генотипирования, то есть на многопробирном подходе, который в большинстве случаев выявляет лежащие в основе аллельные выпадения или сдвиги аллелей из-за плохой амплификации (Taberlet et al. 1996). Другая возможность состоит в том, чтобы учесть определенный уровень толерантности к несоответствию при условии, что набрано достаточное количество локусов. Затем, основываясь на мультилокусном генотипе, различия, вызванные ошибками генотипирования, можно отличить от тех, которые являются фактическими различиями между двумя генотипами, по небольшому количеству несовпадений (McKelvey and Schwartz 2004).Третий вариант сочетает в себе два предыдущих, с реплицированным генотипированием только для образцов, в которых наблюдались три или меньше несовпадений в разных локусах. Эти мультилокусные генотипы повторно оцениваются после повторного типирования, чтобы доказать, что они являются разными генотипами в действительности, но увеличение стоимости репликации ПЦР сводится к минимуму (Zhang et al. 2006). В этом пилотном исследовании мы применили многотрубный подход с тремя повторами для обеспечения максимальной точности. Однако с учетом того, что гораздо больше образцов поступает для анализа в MGC и, таким образом, увеличивается справочная база данных молекулярных профилей, третий (комбинированный) вариант представляется адекватным и в настоящее время проходит испытания.
Группировка, выявленная кластерным анализом UPGMA, соответствовала характеристике, основанной на морфотаксономической классификации образцов (рис. И). Секция Callimusa, однако, не сформировала отдельный кластер, что отражает ее противоречивую позицию и согласуется с ранее сообщавшейся близкой связью с видами Australimusa (Jarret and Gawel 1995; Wong et al. 2001 b , 2002). Также тесная связь между Родохламисом и М.acuminata видов (Wong et al. 2002; Bartoš et al. 2005; Li et al. 2010; Liu et al. 2010). Набор маркеров позволял различать до уровня отдельных подгрупп / подвидов. Степень полиморфизма варьировалась между подгруппами и подвидами, и полиморфные сайты все еще можно было найти внутри подгрупп и подвидов. Например, в отличие от исследования Creste et al. (2003), которые не смогли найти полиморфные локусы среди подгруппы Кавендиш бананов в своем исследовании на основе шести SSR-локусов, набор маркеров, использованный в нашем исследовании, действительно предоставил полиморфные локусы среди трех представителей подгруппы Кавендиш, что позволяет их различие.Очевидно, что большее количество подсчитанных локусов увеличивает возможность обнаружения достаточного количества полиморфных локусов. С другой стороны, ограничения в разрешении микросателлитных маркеров становятся очевидными при анализе соматических мутантов; поскольку они имеют общее происхождение, генетическая изменчивость, которая сужается за счет циклов вегетативного размножения, может не отражаться в их молекулярном профиле SSR (Cipriani et al. 1994; Creste et al 2003; Esselink et al. 2003).Поскольку большинство коммерческих сортов бананов являются клонами, размножающимися вегетативно, оценка их генетической изменчивости с помощью набора маркеров, протестированных в этом исследовании, может быть неудачной и еще не подтверждена. Тем не менее, он по-прежнему представляет собой очень полезную платформу для молекулярной характеристики неизвестных образцов и оценки генетической целостности коллекций зародышевой плазмы Musa .
Хотя микросателлиты использовались в качестве надежных маркеров для проектов с разделением труда между лабораториями (Bredemeijer et al. 2002; Röder et al. 2002), несколько работ показали, что существует значительный уровень несоответствия между результатами, полученными на разных рабочих местах, что усложняет переносимость и сопоставимость данных (Jones et al. 1997; Weeks et al. 2002; This et al. 2004; Van Treuren et al. 2010). В свете этого предпочтительным вариантом представляется централизация деятельности по генотипированию в Musa и его стандартизация в качестве услуги исследовательскому сообществу.Помимо простого контроля качества, основное средство позволит использовать другие методы для поддержки генотипирования, такие как проточная цитометрическая оценка уровня плоидности и / или размера генома, имея в виду, что обработка данных генотипирования различается для диплоидных и полиплоидных присоединения (см. Материалы и методы). Очевидно, что требования к переносу пробы можно свести к минимуму, если оба типа анализа будут выполняться в одном месте. Более того, с каждой новой выборкой, проходящей через анализ, база данных эталонных профилей SSR расширяется, и повышается вероятность идентификации ближайшего родственника или точно совпадающего образца.
На основании наших результатов, полученных с использованием маркеров SSR, представленных в этой работе, и маркеров Hřibová et al . (2011), полученные с помощью ITS, а также многолетний опыт в проточной цитометрии ДНК (Doležel 1991; Lysák et al. 1999; Roux et al. 2003; Bartoš et al. 2005; Doleželová et al. al. 2005), MGC был создан в Институте экспериментальной ботаники в Оломоуце (Чешская Республика) под эгидой Bioversity International (http: // olomouc.ueb.cas.cz/musa-genotyping-centre). Центр обслуживает все научное и племенное сообщество Musa . Более того, платформа для генотипирования уже включена в конвейер для характеристики недавно введенных образцов в международную коллекцию зародышевой плазмы бананов (ITC). В этом трубопроводе образцы свежей ткани листа для молекулярной характеристики поступают в MGC, где они подвергаются измерению уровня плоидности с помощью проточной цитометрии; ДНК экстрагируют и используют для сбора профилей SSR 19 маркеров, как описано выше.В некоторых случаях, когда результаты генотипирования SSR недостаточно убедительны для надежной классификации неизвестных образцов, анализ последовательности ITS в соответствии с Hřibová et al. (2011). Хотя очевидно, что новые высокопроизводительные подходы к генотипированию с высоким содержанием контента и высокой пропускной способностью постепенно вытеснят системы на основе маркеров, мы уверены, что описанная здесь платформа предлагает хорошо обоснованный и готовый к использованию подход, который можно применить немедленно. и который предлагает более высокую гибкость в масштабировании анализа с учетом размера выборки, экономической эффективности и времени обработки результатов.
Выводы и взгляд на будущее
Платформа для генотипирования зародышевой плазмы Musa , описанная здесь, обеспечивает надежный и воспроизводимый подход для характеристики генетической изменчивости этой важной культуры, поддержки управления коллекциями зародышевой плазмы и прямого выбора генотипа для селекции улучшенных сортов. База данных молекулярных профилей продолжает расти с каждым новым образцом, проходящим через аналитический конвейер, что приводит к постепенному улучшению группировки и, как следствие, увеличению шансов найти точное совпадение для неизвестных образцов.В рамках будущих планов в анализ будет включена партия тетраплоидных образцов, чтобы сделать его более универсальным и удовлетворяющим всем возможным требованиям для молекулярной характеристики разнообразного генофонда Musa .
Дополнительная информация
Следующая дополнительная информация доступна в онлайн-версии этой статьи —
Файл 1: Таксономические данные образцов эталонной коллекции ДНК.
Файл 2: Список дополнительных диплоидных образцов из коллекции ITC (хранящейся в местной теплице), включенных в анализ.
Файл 3: Список закодированных образований, включенных в слепой тест.
Файл 4: Подробные результаты анализа последовательности ITS слепого образца № 4 и его предполагаемый соответствующий эталонный образец — M. acuminata ssp. malaccensis (ITC 0250).
Файл 5: Список дубликатов, выявленных среди проанализированных генотипов.
Источники финансирования
Эта работа была поддержана Bioversity International (LOA CfL 2009/48 и LoA CfL 2010/58), Агентством внутренних грантов Университета Палацкого, Оломоуц, Чешская Республика (грант No.Prf-2010-001), а также Министерством образования, молодежи и спорта Чешской Республики и Европейским фондом регионального развития (Оперативная программа исследований и разработок для инноваций № CZ.1.05 / 2.1.00 / 01.0007).
Вклад авторов
Все авторы внесли свой вклад, прочитали и одобрили рукопись.
Заявление о конфликте интересов
Не объявлено.
Благодарности
Мы благодарим нашу коллегу Марию Зейфертову за ее отличную техническую помощь.Работа Павлы Кристеловой, Мирослава Валарика, Евы Грибовой, Николаса Ру, Стефани Канальер и Ярослава Долежеля проводилась в контексте проекта координированных исследований МАГАТЭ «Молекулярные инструменты для улучшения качества вегетативно размножаемых культур, включая бананы и маниоку» ({«тип»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «D23027», «term_id»: «426951», «term_text»: «D23027»}} D23027) и Совместная программа ФАО / МАГАТЭ.
Ссылки
- Бартош Дж., Алхимова О., Долежелова М., Де Ланге Е., Долежел Й.Размер ядерного генома и геномное распределение рибосомной ДНК в Musa и Ensete (Musaceae): таксономические последствия. Цитогенетические и геномные исследования. 2005; 109: 50–57. DOI: 10,1159 / 000082381. [PubMed] [Google Scholar]
- Бонин А., Беллемейн Э, Бронкен Эйдесен П., Помпанон Ф., Брокманн С., Таберлет П. Как отслеживать и оценивать ошибки генотипирования в популяционно-генетических исследованиях. Молекулярная экология. 2004. 13: 3261–3273. DOI: 10.1111 / j.1365-294X.2004.02346.x. [PubMed] [Google Scholar]
- Bredemeijer GMM, Cooke R, Ganal M, Peeters R, Isaac P, Norordijk Y, Rendell S, Jackson J, Röder MS, Wendehake K, Dijcks M, Amelaine M, Wickaert V, Bertrand L , Восман Б.Создание и тестирование базы данных микроспутников, содержащей более 500 сортов томатов. Теоретическая и прикладная генетика. 2002; 105: 1019–1026. DOI: 10.1007 / s00122-002-1038-6. [PubMed] [Google Scholar]
- Buhariwalla HK, Jarret RL, Jayashree B, Crouch JH, Ortiz R. Выделение и характеристика микросателлитных маркеров из Musa balbisiana . Заметки о молекулярной экологии. 2005; 5: 327–330. DOI: 10.1111 / j.1471-8286.2005.00916.x. [Google Scholar]
- Cheesman EE. Классификация бананов II.Род Musa L. Kew Bulletin. 1947; 2: 106–117. DOI: 10.2307 / 4109207. [Google Scholar]
- Cipriani G, Frazza G, Peterlunger E, Testolin R. Снятие отпечатков пальцев с виноградной лозы с использованием микросателлитных повторов. Vitis. 1994; 33: 211–215. [Google Scholar]
- Creste S, Neto AT, Silva SD, Figueira A. Генетическая характеристика сортов бананов ( Musa spp.) Из Бразилии с использованием микросателлитных маркеров. Euphytica. 2003. 132: 259–268. DOI: 10,1023 / А: 1025047421843. [Google Scholar]
- Крауч Х. К., Крауч Дж. Х., Джаррет Р. Л., Креган П. Б., Ортис Р.Расщепление микросателлитных локусов в гаплоидных и диплоидных гаметах Musa . Наука о растениеводстве. 1998. 38: 211–217. DOI: 10.2135 / cropci1998.0011183X003800010035x. [Google Scholar]
- Крауч Х. К., Крауч Дж. Х., Мадсен С., Вуйлстеке Д. Р., Ортис Р. Сравнительный анализ фенотипического и генотипического разнообразия местных сортов подорожника ( Musa spp., Группа AAB) Теоретическая и прикладная генетика. 2000; 101: 1056–1065. DOI: 10.1007 / s001220051580. [Google Scholar]
- Де Ланге Э, Пиллэй М., Тенкоуано А., Свеннен Р.Интеграция морфологической и молекулярной таксономии в Musa : африканские подорожники ( Musa spp. Группа AAB). Систематика и эволюция растений. 2005. 255: 225–236. DOI: 10.1007 / s00606-005-0346-0. [Google Scholar]
- Doležel J. Проточный цитометрический анализ содержания ядерной ДНК у высших растений. Фитохимический анализ. 1991; 2: 143–154. DOI: 10.1002 / pca.2800020402. [Google Scholar]
- Долежелова М., Долежел Дж., Ван ден Хоуве I, Ру Н., Свеннен Р. Сосредоточьтесь на коллекции Musa : выявлены уровни плоидности.InfoMusa. 2005; 14: 34–36. [Google Scholar]
- Эльшир Р.Дж., Глаубиц Дж.С., Сан К.Ю., Польша Дж.А., Кавамото К., Баклер Е.С., Митчелл С.Е. Надежный и простой подход к генотипированию путем секвенирования (GBS) для видов с большим разнообразием. Plos One. 2011; 6: e19379. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Esselink GD, Smulders MJ, Vosman B. Идентификация срезанной розы ( Rosa hybrida ) и разновидностей подвоя с использованием надежных маркеров микросателлитных сайтов с метками последовательностей. Теоретическая и прикладная генетика.2003. 106: 277–286. [PubMed] [Google Scholar]
- Гавел Нью-Джерси, Джаррет Р.Л., Виттемор А.П. Филогенетический анализ Musa на основе полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (ПДРФ). Теоретическая и прикладная генетика. 1992; 84: 286–290. [PubMed] [Google Scholar]
- Грапин А., Нойер Дж.Л., Каррел Ф., Дамбье Д., Бауренс ФК, Лано С., Лагода П.Ж. Генетическое разнообразие диплоида Musa acuminata проанализировано с использованием микросателлитных сайтов, меченных последовательностями. Электрофорез. 1998; 19: 1374–1380. DOI: 10.1002 / elps.11501. [PubMed] [Google Scholar]
- Hayden MJ, Nguyen TM, Waterman A, McMichael GL, Chalmers KJ. Применение мультиплексной ПЦР для флуоресцентного генотипирования SSR ячменя и пшеницы. Молекулярное разведение. 2007. 21: 271–281. DOI: 10.1007 / s11032-007-9127-5. [Google Scholar]
- Ипполит I, Бакри Ф., Сегин М., Гардес Л., Риваллан Р., Риструччи А. М., Дженни С., Перье Х, Каррел Ф., Аргу Икс, Пиффанелли П., Хан И. А., Миллер ГСЧ, Папас Г. Дж., Мбеги- A-Mbéguié D, Matsumoto T., De Bernardinis V, Huttner E, Kilian A, Baurens FC, D’Hont A, Cote1 F, Courtois B, Glaszmann JC.Насыщенная карта сцепления SSR / DArT Musa acuminata , касающаяся перестройки генома среди бананов. BMC Plant Biology. 2010; 10: 65. DOI: 10.1186 / 1471-2229-10-65. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Hřibová E, Čížková J, Christelová P, Taudien S, de Langhe E, Doležel J. Область последовательности ITS1–5.8S-ITS2 в Musaceae: структура, разнообразие и использование в молекулярной филогении. PLoS ONE. 2011; 6: e17863. DOI: 10.1371 / journal.pone.0017863. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- INIBAP.Глобальная стратегия сохранения Мусы (банана и подорожника). Консультативный документ, подготовленный INIBAP в сотрудничестве с многочисленными партнерами из сообщества исследователей и разработчиков Musa. Франция: INIBAP; 2006. [Google Scholar]
- Jarret RL, Gawel NJ. Молекулярные маркеры, генетическое разнообразие и систематика. В: Гоуэн С., редактор. Бананы и бананы. Лондон: Чепмен и Холл; 1995. С. 67–83. [Google Scholar]
- Jones CJ, Edwards KJ, Castaglione S, Winfield MO, Sala F, Van de Wiel C, Bredemeijer G, Vosman B, Matthes M, Daly A, Brettschneider R, Bettini P, Buiatti M, Maestri E, Мальчевски А., Мармироли Н., Аэрт Р., Фолькаерт Дж., Руэда Дж., Линасеро Р., Васкес А., Карп А.Тестирование воспроизводимости маркеров RAPD, AFLP и SSR на растениях в сети европейских лабораторий. Молекулярное разведение. 1997; 3: 381–390. DOI: 10,1023 / А: 1009612517139. [Google Scholar]
- Kaemmer D, Fischer D, Jarret RL, Baurens FC, Grapin A, Dambier D, Noyer JL, Lanaud C, Kahl G, Lagoda PJL. Молекулярное разведение в роду Musa : веские аргументы в пользу маркерной технологии STMS. Euphytica. 1997. 96: 49–63. DOI: 10,1023 / А: 10026294. [Google Scholar]
- Lagoda PJL, Noyer JL, Dambier D, Baurens FC, Grapin A, Lanaud C.Маркеры микросателлитных сайтов, меченных последовательностью (STMS), у Musaceae. Молекулярная экология. 1998. 7: 657–666. DOI: 10.1046 / j.1365-294X.1998.00340.x. [PubMed] [Google Scholar]
- Li LF, Häkkinen M, Yuan YM, Hao G, Ge XJ. Молекулярная филогения и систематика семейства бананов (Musaceae), выведенная на основе множественных ядерных и хлоропластных фрагментов ДНК, со специальной ссылкой на род Musa . Молекулярная филогенетика и эволюция. 2010; 57: 1–10. DOI: 10.1016 / j.ympev.2010.06.021. [PubMed] [Google Scholar]
- Лю А.З., Кресс В.Дж., Ли Д.З.Филогенетический анализ семейства бананов (Musaceae) на основе данных ядерных рибосом (ITS) и хлоропластов ( трлн L-F). Таксон. 2010; 59: 20–28. [Google Scholar]
- Лю К., Muse SV. PowerMarker: интегрированная среда анализа данных генетических маркеров. Биоинформатика. 2005; 21: 2128–2129. DOI: 10.1093 / биоинформатика / bti282. [PubMed] [Google Scholar]
- Loh JP, Kiew R, Set O, Gan LH, Gan YY. Фингерпринт полиморфизма длин амплифицированных фрагментов для 16 сортов банана ( Musa cvs.) Молекулярная филогенетика и эволюция. 2000. 17: 360–366. DOI: 10.1006 / mpev.2000.0848. [PubMed] [Google Scholar]
- Лысак М.А., Долежелова М., Хорри Дж. П., Свеннен Р., Долежел Дж. Проточный цитометрический анализ содержания ядерной ДНК в Musa . Теоретическая и прикладная генетика. 1999; 98: 1344–1350. DOI: 10.1007 / s001220051201. [Google Scholar]
- МакКелви К.С., Шварц М.К. Генетические ошибки, связанные с оценкой популяции с использованием неинвазивной молекулярной маркировки: проблемы и новые решения.Журнал управления дикой природой. 2004. 68: 439–448. DOI: 10.2193 / 0022-541X (2004) 068 [0439: GEAWPE] 2.0.CO; 2. [Google Scholar]
- Michener CD, Sokal RR. Количественный подход к проблеме классификации. Эволюция. 1957; 11: 490–499. [Google Scholar]
- Nei M. Анализ разнообразия генов в разделенных популяциях. Труды Национальной академии наук США. 1973; 70: 3321–3323. DOI: 10.1073 / pnas.70.12.3321. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Ning SP, Xu LB, Lu Y, Huang BZ, Ge XJ.Геномный состав и генетическое разнообразие зародышевой плазмы Musa из Китая, выявленные с помощью маркеров ПЦР-ПДРФ и SSR. Scientia Horticulturae. 2007. 114: 281–288. DOI: 10.1016 / j.scienta.2007.07.002. [Google Scholar]
- Nwakanma DC, Pillay M, Okoli BE, Tenkouano A. ПЦР-ПДРФ внутренних транскрибированных спейсеров (ITS) рибосомной ДНК предоставляет маркеры геномов A и B в Musa L. Теоретическая и прикладная генетика. 2003. 108: 154–159. DOI: 10.1007 / s00122-003-1402-1. [PubMed] [Google Scholar]
- Паэткау Д., Калверт В., Стирлинг И., Стробек К.Микросателлитный анализ структуры популяции канадских белых медведей. Молекулярная экология. 1995; 4: 347–354. DOI: 10.1111 / j.1365-294X.1995.tb00227.x. [PubMed] [Google Scholar]
- Page RDM. TREEVIEW: приложение для отображения филогенетических деревьев на персональных компьютерах. Компьютерные приложения в биологических науках. 1996. 12: 357–358. [PubMed] [Google Scholar]
- Pessoa-Filho M, Beló A, Alcochete AAN, Rangel PHN, Ferreira ME. Набор мультиплексных панелей микросателлитных маркеров для быстрой молекулярной характеристики образцов риса.BMC Plant Biology. 2007; 7: 23. DOI: 10.1186 / 1471-2229-7-23. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Pillay M, Nwakanma DC, Tenkouano A. Идентификация маркеров RAPD, связанных с последовательностями генома A и B в геноме Musa L. 2000; 43: 763–767. [PubMed] [Google Scholar]
- Pillay M, Ogundiwin E, Nwakanma DC, Ude G, Tenkouano A. Анализ генетического разнообразия и взаимосвязей в зародышевой плазме бананов в Восточной Африке. Теоретическая и прикладная генетика. 2001; 102: 965–970. DOI: 10.1007 / s001220000500. [Google Scholar]
- Pompanon F, Bonin A, Bellemain E, Taberlet P. Ошибки генотипирования: причины, последствия и решения. Природа Обзоры Генетики. 2005; 6: 847–859. DOI: 10,1038 / NRG1707. [PubMed] [Google Scholar]
- Риструччи А.М., Ипполит I, Перье X, Ся Л., Кайг В., Эверс М., Хаттнер Э., Килиан А., Гласманн Дж. Разработка и оценка технологии разнообразных массивов для высокопроизводительных анализов ДНК в Musa . Теоретическая и прикладная генетика. 2009; 119: 1093–1103.DOI: 10.1007 / s00122-009-1111-5. [PubMed] [Google Scholar]
- Röder MS, Wendehake K, Korzun V, Bredemeijer G, Laborie D, Bertrand L, Isaac P, Rendell S, Jackson J, Cooke RJ, Vosman B, Ganal M. Построение и анализ микроспутниковая база данных европейских сортов пшеницы. Теоретическая и прикладная генетика. 2002; 106: 67–73. [PubMed] [Google Scholar]
- Roux N, Toloza A, Radecki Z, Zapata-Arias FJ, Doležel J. Быстрое обнаружение анеуплоидии в Musa с помощью проточной цитометрии.Отчеты о растительных клетках. 2003. 21: 483–490. [PubMed] [Google Scholar]
- Ruangsuttapha S, Eimert K, Schröder MB, Silayoi B, Denduangboripant J, Kanchanapoom K. Молекулярная филогения сортов бананов из Таиланда на основе маркеров HAT-RAPD. Генетические ресурсы и эволюция сельскохозяйственных культур. 2007. 54: 1565–1572. DOI: 10.1007 / s10722-006-9169-2. [Google Scholar]
- Шуэльке М. Экономичный метод флуоресцентной маркировки фрагментов ПЦР. Природа Биотехнологии. 2000. 18: 233–234. DOI: 10,1038 / 72708. [PubMed] [Google Scholar]
- Simmonds NW, Shepherd K.Таксономия и происхождение культурных бананов. Ботанический журнал Линнеевского общества. 1955; 55: 302–312. DOI: 10.1111 / j.1095-8339.1955.tb00015.x. [Google Scholar]
- Stover RH, Simmonds NW. Бананы. 3-е изд. Burnt Mill, Harlow: Longman Scientific and Technical; 1987. [Google Scholar]
- Taberlet P, Griffin S, Goossens B, Questiau S, Manceau V, Escaravage N, Waits LP, Bouvet J. Надежное генотипирование образцов с очень низким количеством ДНК с помощью ПЦР. Исследования нуклеиновых кислот. 1996. 24: 3189–3194.DOI: 10.1093 / nar / 24.16.3189. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Testolin R, Marrazzo T, Cipriani G, Quarta R, Verde I, Dettori MT, Pancaldi M, Sansavini S. Микросателлитная ДНК в персике ( Prunus persica L. Batsch ) и его использование для снятия отпечатков пальцев и тестирования генетического происхождения сортов. Геном. 2000. 43: 512–520. [PubMed] [Google Scholar]
- This P, Jung A, Boccaccii P, Borrego J, Botta R, Constantini L, Crespan M, Dangl GS, Eisenheld C, Ferreira-Monteiro F, Grando S, Ibañez J, Lacombe T., Laucou V, Magalhães R, Meredith CP, Milani N, Peterlung E, Regner F, Zulini L, Maul E.Разработка стандартного набора микросателлитных референсных аллелей для идентификации сортов винограда. Теоретическая и прикладная генетика. 2004; 109: 1448–1458. DOI: 10.1007 / s00122-004-1760-3. [PubMed] [Google Scholar]
- Удэ Дж., Пиллай М., Нваканма Д., Тенкоуано А. Генетическое разнообразие у Musa acuminata Colla и Musa balbisiana Colla и некоторых из их естественных гибридов с использованием маркеров AFLP. Теоретическая и прикладная генетика. 2002; 104: 1246–1252. DOI: 10.1007 / s00122-002-0914-4.[PubMed] [Google Scholar]
- Ван Треурен Р., Кемп Х., Эрнстинг Дж., Йонгеянс Б., Хаутман Х., Виссер Л. Микросателлитное генотипирование генетических ресурсов яблони ( Malus x domestica Borkh.) В Нидерландах: приложение в коллекции менеджмент и идентификация сортов. Генетические ресурсы и эволюция сельскохозяйственных культур. 2010. 57: 853–865. DOI: 10.1007 / s10722-009-9525-0. [Google Scholar]
- Venkatachalam L, Sreedhar RV, Bhagyalakshmi N. Использование генетических маркеров для обнаружения полиморфизма ДНК, идентификации генотипа и филогенетических отношений между сортами бананов.Молекулярная филогенетика и эволюция. 2008; 47: 974–985. DOI: 10.1016 / j.ympev.2008.03.017. [PubMed] [Google Scholar]
- Virk PS, Newbury HJ, Jackson TM, Ford-Lloyd BV. Идентификация повторяющихся образцов в коллекции зародышевой плазмы риса с использованием анализа RAPD. Теоретическая и прикладная генетика. 1995; 90: 1049–1055. [PubMed] [Google Scholar]
- Wagner HW, Sefc KM. ИДЕНТИЧНОСТЬ 1.0. Вена: Центр прикладной генетики Университета сельскохозяйственных наук; 1999. [Google Scholar]
- Wang JY, Zheng LS, Huang BZ, Liu WL, Wu YT.Развитие, характеристика и анализ изменчивости микросателлитов коммерческого сорта Musa acuminata . Генетические ресурсы и эволюция сельскохозяйственных культур. 2010. 57: 553–563. DOI: 10.1007 / s10722-009-9493-4. [Google Scholar]
- Wang XL, Chiang TY, Roux N, Hao G, Ge XJ. Генетическое разнообразие дикого банана ( Musa balbisiana Colla) в Китае по маркерам AFLP. Генетические ресурсы и эволюция сельскохозяйственных культур. 2007. 54: 1125–1132. DOI: 10.1007 / s10722-006-9004-9. [Google Scholar]
- Веб-сайт 1. Global Musa Genomics Consortium http://www.musagenomics.org/cetest_firstpage1/genomic_dna.html. (28 января 2011 г.)
- Weeks DE, Conley YP, Ferrell RE, Mah TS, Gorin MB. История двух генотипов: согласованность между двумя высокопроизводительными центрами генотипирования. Геномные исследования. 2002; 12: 430–435. DOI: 10.1101 / gr.211502. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Weising K, Nybom H, Wollf K, Kahl G. Дактилоскопия ДНК растений. Принципы, методы и приложения. 2-е изд.Лондон: Тейлор и Фрэнсис; 2005. [Google Scholar]
- Wong C, Kiew R, Loh JP, Gan LH, Set O, Lee SK, Lum S, Gan YY. Генетическое разнообразие дикого банана Musa acuminata Colla в Малайзии по данным AFLP. Летопись ботаники. 2001a; 88: 1017–1025. DOI: 10.1006 / анбо.2001.1542. [Google Scholar]
- Вонг С., Кью Р., Он С., Лэмб А., Ли С. К., Ган Л. Х., Ган Й. Секционное размещение трех борнейских видов Musa (Musaceae) на основе AFLP. Вестник Gardenś Сингапур.2001b; 53: 327–341. [Google Scholar]
- Wong C, Kiew R, Argent G, Set O, Lee SK, Gan YY. Оценка достоверности разделов в Musa (Musaceae) с использованием AFLP. Летопись ботаники. 2002; 90: 231–238. DOI: 10.1093 / AOB / MCF170. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
- Zhang D, Mischke S, Goenaga R, Hemeida AA, Saunders JA. Точность и надежность высокопроизводительного микросателлитного генотипирования для идентификации клонов какао. Наука о растениеводстве. 2006; 46: 2084–2092. DOI: 10.2135 / cropci2006.01.0004. [Google Scholar]
Дэвид Ист — Почему сложно измерить производительность рендеринга на стороне сервера
Большинство вещей в веб-разработке сложны.
Я начал эту публикацию две недели назад как простую статью «Как использовать SSR для повышения производительности». После нескольких часов профилирования и консультаций с людьми более умными, чем я, я знаю одно. Рендеринг на стороне сервера содержит больше нюансов, чем вам хотелось бы.
Вам, вероятно, говорили, что рендеринг вашего сайта JavaScript на стороне сервера повысит производительность.Но правда ли это? В этой статье мы проверим это предположение. Спойлер: ответ может быть.
Это не статья, посвященная SSR. SSR все еще может помочь с производительностью в определенных сценариях. Вам просто нужно помнить, почему вы вообще хотите использовать SSR.
JavaScript сковывает содержимое одностраничного приложения
По умолчанию для одностраничного приложения используется элемент «app» с некоторыми скриптами. После запуска скриптов элемент «приложение» превращается в значимое содержание.
index.html
Мое приложение без SSR
Это не оптимальная схема загрузки. Браузер может отображать страницу только с помощью HTML и CSS. Мы могли бы отображать контент на экране еще до того, как браузер коснется скрипта.
Суть SSR — более быстрая отрисовка значимого контента
Цель SSR: компенсировать затраты на привязку значимого контента в JavaScript. Если JavaScript связывает контент, вы можете ожидать, что будете смотреть на белый экран дольше, чем хотелось бы. Что, если бы вы могли съесть свой торт и тоже?
Что, если вы отправите статическую HTML-версию приложения во время загрузки JavaScript? Как только JavaScript будет готов, он сможет занять страницу, и все будут довольны. Проблема решена, да?
Сравнить SSR vs.Версии без SSR
Я создал сайт о поддельной обуви под названием «Shoeniversal». Вы либо любите, либо ненавидите это имя. Я создал его с помощью Angular Universal, но концепции применимы и к другим фреймворкам, поддерживающим SSR. Вы можете просмотреть исходный код на Github.
Я опубликовал две версии сайта на Firebase Hosting. Одна версия отображается на стороне сервера, а другая — нет.
Сайт без SSR статичен. Сайт SSR статичен с динамическим поворотом. Cloud Functions генерирует сайт SSR и затем отправляет его на границу CDN.Граница кэширует отображаемый на сервере контент, как если бы это был статический сайт. Таким образом, вы можете рассчитывать на одинаковую доставку для каждого сайта.
Чтобы получить хороший тест, я использовал Webpagetest. WPT великолепен, потому что позволяет тестировать на реальных мобильных устройствах, в медленных сетях, в разных частях мира… бесплатно .
Заявление об ограничении ответственности
Я хочу отметить, что в этой статье используются данные, полученные только при построении этого образца. SSR — нечеткая тема. Как сообщество, мы все еще пытаемся придумать правильное руководство по внедрению.Эта статья — попытка развить эти усилия. Не стесняйтесь начинать разговор, если вы обнаружите какие-либо ошибки или у вас есть комментарии.
Тест на реальных устройствах в медленных сетях
Я провел ряд тестов на «Развивающихся рынках» (EM), используя Moto G4. Задержка на настройке EM очень велика. Добраться до сервера и обратно с телефона стоит 400мс. Это даже не включает время загрузки объекта.
Учитывая эти параметры, я рассчитывал, что сайт SSR выиграет.Первые результаты показали, что я ошибался.
Версия SSR была медленнее
Тестовый прогон без SSR. Тестовый запуск SSR.
Тест за тестом Webpagetest дал мне лучшие показатели для сайта без SSR. Время загрузки и время взаимодействия были лучше. Что-то мне бросилось в глаза. Start Render и Speed Index были быстрее на сайте SSR. Это не складывалось.
Как можно получить более быструю окраску, но при этом сократить время загрузки? Как может ухудшиться производительность, если вы начнете внедрять передовой опыт? Если вы действительно хотите увидеть, что происходит, вам нужно пройти старую проверку зрения.
Сайты SSR становятся интерактивными, а затем снова блокируют основной поток
Взгляните на временную шкалу Chrome DevTools для сайта SSR.
- ~ 2400 мс : загрузка HTML и CSS. Появляется значимый контент.
- ~ 3800 мс : Angular, его полифиллы и загрузка кода приложения.
- ~ 4300 мс : выполнение JavaScript завершено. Сайт интерактивный.
- ~ 4900 мс : время загрузки. Запускается событие «Документ завершен».
- Временная шкала
Мы разыграли браузер. Через 2,4 секунды браузер лишь на мгновение считает сайт интерактивным. Затем идет JavaScript.
Примерно через 3,6 секунды начинается выполнение JavaScript и блокирует основной поток до 4,3 секунды. Это наживка и выключатель. Браузер думает, что готов к работе, но затем приходит JavaScript и останавливает сайт.
Webpagetest сообщает нам, что время загрузки составляет 4,9 секунды. Однако мы видим полное приложение на 2.4 секунды и взаимодействовать с ним за 4,3 секунды. Показатель «Время загрузки» здесь не так важен.
Временная шкала и начальные показатели рассказывают похожую историю. Однако это не относится к версии без SSR.
Поздние HTTP-запросы затрудняют получение показателей интерактивности
Сайт без SSR может иметь более быстрое «время загрузки» и интерактивные показатели, но это еще не все.
- ~ 2400 мс : загрузка HTML и CSS.Нет значимого содержания.
- ~ 3500 мс : Angular, его полифиллы и загрузка кода приложения.
- ~ 3800 мс : выполнение JavaScript завершено. Сайт считается интерактивным.
- ~ 4100 мс : время загрузки. Запускается событие «Документ завершен». Framework отправляет HTTP-запросы на данные.
- ~ 6200 мс : полезная нагрузка, полученная от вызовов API. Angular отображает значимый контент.
- Временная шкала
Это не похоже на 4.1 секунда «Время загрузки». Да, через четыре секунды сработало событие «Документ завершен». Однако это не отражало реальности. У этого приложения есть HTTP-запросы на получение данных, которые выполняются только через 6,2 секунды. И все же браузеру необходимо загрузить и отобразить изображение главного героя.
Это непростая ситуация. Метрики говорят вам, что Non-SSR быстрее становится интерактивным. Однако вы можете видеть, что сайт не работает до 6,2 секунды, а версия SSR интерактивна через 4,3 секунды.
Это мягкий пример. В версии без SSR есть хоть что расписать. Представьте, что вызов API заблокировал всю визуализацию. Есть еще один вызов API для содержимого в нижней части страницы, который выполняется не раньше, чем через 6,6 секунды. Если сайт выполняет все эти вызовы API, , почему они не отменили интерактивность?
Выполнение JavaScript менее 50 мс не влияет на интерактивность
Вы можете счесть это несправедливым тестом. Версия SSR не выполняет вызовов API на стороне клиента.Однако в этом преимущество SSR. Вызовы API выполняются на стороне сервера, а состояние приложения передается клиенту. Для получения данных вызовы API должны выполняться на сайте без SSR. Это то, что обманывает наши показатели интерактивности.
Time to Interactive (TTI) сообщает нам, сколько времени проходит между навигацией и интерактивностью. Показатель определяется просмотром пятисекундного окна. В этом окне никакие задачи JavaScript не могут занимать более 50 мс. Если возникает задача длительностью более 50 мс, поиск пятисекундного окна начинается заново.
После завершения вызовов API потребовалось всего 26 мсек для выполнения JavaScript, который отображал контент на странице. Это не привело к снижению интерактивности. Это ставит пользователя в жуткую долину. Сайт интерактивен, но бесполезен до тех пор, пока не вернутся данные.
- Стоит также отметить, что Angular смог обработать это изменение за 26 мс на устройстве с низким энергопотреблением.
SSR выиграл в этом сценарии
В этом сценарии SSR был выгоден.Стоимость ожидания завершения вызовов API на клиенте была слишком высокой. Сайт Non-SSR стал интерактивным раньше. Но интерактивный сайт без значимого содержания — это не совсем тот интерактив, который мы ищем.
SSR обходится дорого.
Для соединений с высокой задержкой время приема-передачи является дорогостоящим налогом на производительность. Рендеринг на стороне сервера доставляет контент в виде единого фрагмента. Это избавляет пользователя от ожидания нескольких HTTP-вызовов, чтобы увидеть завершенный сайт.
Однако за это приходится платить.У пользователя могут возникнуть неприятные ощущения на странице. Страница перейдет из интерактивной в замороженную и обратно в интерактивную.
Сайт SSR замедлил обработку изображений. Сайт SSR обрабатывал изображения, пока основной поток был занят. Это заняло лишние 2-3 секунды.
Несмотря на такую медленную обработку, изображения сайта SSR появились раньше, чем изображения сайта Non-SSR. Это связано с поздним обнаружением изображений в версии без SSR.
Вывод №1: SSR может повысить производительность, когда HTTP-вызовы блокируют значительную отрисовку
В этом сценарии SSR был преимуществом, потому что он сокращал цепочку запросов, необходимых для использования сайта.Самым важным является отсутствие HTTP-вызовов для данных. Однако, если ваш сайт не зависит от HTTP-запросов на стороне клиента для получения данных, SSR может не принести вам пользы.
Вывод № 2: Используйте проверку зрения
Предварительно классифицированные метрики — хороший сигнал для измерения производительности. В конце концов, они могут не отражать должным образом историю эффективности вашего сайта. Профилируйте каждую возможность и проверьте ее на глаз.
Вывод № 3: По возможности выбирайте статический
Лучший способ расставить приоритеты для контента путем создания статического сайта.Спросите себя, нужен ли для контента JavaScript. Shoeniversal — это целевая страница «только для чтения», она должна быть статичной. Я все еще могу использовать Angular Universal для рендеринга этого приложения на стороне сервера. Сделать сайт статичным — просто удалить теги JavaScript из документа.
Без JavaScript сайт загружается и становится интерактивным за 2 секунды.
SSR не универсален
Рендеринг на стороне сервера — отличный метод для определения приоритетов контента. Однако это далеко не то, чтобы съесть свой торт и съесть его.Это не повлияет на результативность каждого. Используйте свое суждение, чтобы выбрать технику, которая лучше всего подходит для вашей ситуации.
Идентификация QTL, связанных с каллогенезом и эмбриогенезом в масличной пальме, с использованием карт генетического сцепления, улучшенных с помощью маркеров SSR
Abstract
Клональное размножение масличной пальмы с помощью культуры тканей — очень неэффективный процесс. Известно, что культивирование тканей зависит от генотипа, причем некоторые генотипы более поддаются культивированию тканей, чем другие.В этом исследовании карты генетического сцепления, обогащенные маркерами простых повторов последовательности (SSR), были разработаны для dura (ENL48) и pisifera (ML161), двух форм плодов масличной пальмы, Elaeis guineensis . Маркеры SSR были сопоставлены с ранее опубликованными родительскими картами на основе маркеров полиморфизма длины амплифицированного фрагмента (AFLP) и полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (RFLP). Новая карта связей ENL48 содержит 148 маркеров (33 AFLP, 38 RFLP и 77 SSR) в 23 группах связей (LG), покрывая общую длину карты 798.0 см. Карта ML161 содержит 240 маркеров (50 AFLP, 71 RFLP и 119 SSR) в 24 LG, покрывающих в общей сложности 1328,1 см. Используя улучшенные карты, были идентифицированы два локуса количественных признаков (QTL), связанных с культивируемостью ткани, каждый для скорости каллусинга и скорости эмбриогенеза. QTL для каллогенеза был идентифицирован в LGD4b ENL48 и объяснил 17,5% фенотипических вариаций. Что касается скорости эмбриогенеза, QTL был обнаружен на LGP16b в ML161 и объяснил 20,1% вариации. Это исследование является первой попыткой идентифицировать QTL, связанный с пригодностью культур тканей масличной пальмы, что является важным шагом на пути к пониманию молекулярных процессов, лежащих в основе клональной регенерации масличной пальмы.
Образец цитирования: Ting N-C, Jansen J, Nagappan J, Ishak Z, Chin C-W, Tan S-G, et al. (2013) Идентификация QTL, связанных с каллогенезом и эмбриогенезом в масличной пальме, с использованием карт генетического сцепления, улучшенных с помощью маркеров SSR. PLoS ONE 8 (1): e53076. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053076
Редактор: Эдвард Дж. Луи, Ноттингемский университет, Соединенное Королевство
Поступила: 11.07.2012; Одобрена: 23 ноября 2012 г .; Опубликован: 29 января 2013 г.
Авторские права: © 2013 Ting et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.
Финансирование: Этот проект финансируется Министерством науки, технологий и инноваций (MOSTI) Малайзии под кодом проекта MMBPP 04-03-T0045-TC3.2. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: У авторов есть следующие интересы. Чеук-Вен Чин работает в FELDA Agricultural Services Sdn. Bhd и Choo Cheah от ACGT Sdn. Bhd. Поддержку в культивировании тканей ладоней оказали: д-р Хамида Муса (и ее предшественник д-р Залеха Мохд. Мидин) и г-жа Халина Мохд Рамли из Guthrie Biotech Laboratory Sdn Bhd; Д-р Махеран Абу Бакар и г-н Ав Хо Тенг из FELDA Agricultural Services Sdn Bhd; Д-р Лим Лун Луи из IOI Corporation Bhd; РС.Хо Юк Ва ранее из United Plantations Bhd; Д-р Азия Мохд Юсофф и г-жа Халила Хафидз из компании Golden Hope Plantations Bhd; Г-жа Сузайни Яхья из лабораторий Эбор; и г-жа Гирли Вонг и г-жа Джойс Чонг из Applied Agriculture Research Sdn Bhd. Г-н Сухайми Шамсуддин, селекционер масличных пальм в FELDA, помогал авторам в поддержании кросса и взятии образцов с пальм. Часть работы, приведшей к этой статье, была проведена в Biometris; Доктор Азхар Мохамад разрешил авторам использовать генетический анализатор ABI3100 (Applied Biosystems, Великобритания) в Nuclear Malaysia.Нет никаких других патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов, которые можно было бы декларировать. Это не влияет на соблюдение авторами всех политик PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами, как подробно описано в руководстве для авторов.
Введение
Клоны масличной пальмы, выращенные в тканевых культурах, пользуются большим спросом из-за их большей однородности и более высоких урожаев по сравнению с обычным материалом для рассады [1]. Текущий коммерческий саженец состоит из гибридов, называемых tenera , которые являются результатом скрещивания пальм dura и pisifera , двух форм плодов африканской масличной пальмы ( Elaeis guineensis Jacq.). Большой разброс до 30,0% от средней урожайности наблюдается у tenera [2]. С другой стороны, сообщалось, что лучшие клоны дают урожай как минимум на 30,0% больше, чем популяции проростков [3], хотя, по общему признанию, существует проблема выбора репрезентативных стандартных сеянцев для клональных испытаний [4]. Хотя прогнозируемое повышение урожайности клоновых пальм на 30,0% вызвало некоторый скептицизм, производители масличных пальм уверены, что в конечном итоге использование клонального посадочного материала приведет к «следующей волне» повышения урожайности.По этой причине в Малайзии двенадцать лабораторий по культивированию тканей масличной пальмы ежегодно производят более двух миллионов клональных пальм (или раметов), в основном для оценки в их собственных организациях [5].
Однако клональное воспроизводство масличной пальмы сопряжено с множеством проблем и, следовательно, требует дальнейших улучшений для удовлетворения постоянно растущего спроса. Слишком долгий период культивирования может привести к появлению аномальных рамок, причины которых все еще исследуются. Этот как таковой можно преодолеть, просто выращивая больше ладоней с большим количеством линий для более коротких прогонов.Но здесь кроется вторая, возможно, более коварная проблема: культивирование тканей масличной пальмы — очень неэффективный процесс, в среднем более 80,0% культур не дают растений [6]. Причины этого неизвестны, но аналогичные результаты получены с культурами тканей других основных экономических культур, таких как рис, табак, картофель и томаты [7]. Следовательно, эффективность культивирования тканей должна быть повышена, если промышленность масличных пальм Малайзии хочет достичь своей цели по производству 40 миллионов раметов к 2017 году [8].
Существуют доказательства того, что культивирование тканей масличной пальмы имеет генетическую основу, причем некоторые генотипы более поддаются культивированию тканей, чем другие [9]. Вопрос в том, можно ли идентифицировать генотипы с улучшенной культивируемостью тканей. У нескольких видов растений геномные локусы, влияющие на культивирование тканей, были нанесены на карту как локусы количественных признаков (QTL) на картах генетического сцепления. QTL, ответственный за пригодность культур тканей, был идентифицирован у риса [10], пшеницы [11] и ячменя [12].Это демонстрирует потенциал этого подхода для идентификации маркеров, связанных с ответом на культуру ткани. Однако до настоящего времени не сообщалось о QTL для культивирования тканей масличной пальмы.
В этом исследовании геномные маркеры и маркеры EST-SSR были созданы и сопоставлены с генетическими картами Ulu Remis Deli dura (ENL48) и Yangambi pisifera (ML161), о которых сообщалось ранее [13]. Использование общих маркеров SSR позволило связать настоящие карты связей со справочной картой масличной пальмы [14].Это также позволило стандартизировать маркировку и ориентацию групп связей с помощью справочной карты. Это исследование является первой попыткой идентифицировать QTL, связанный с пригодностью культур тканей масличной пальмы. В этом отчете также обсуждается возможное применение маркеров, связанных с QTL, для культивирования тканей с целью повышения эффективности клонального размножения в масличной пальме.
Материалы и методы
Составление карты населения
Популяция для картирования (P2) состояла из 87 F 1 пальм, полученных от скрещивания Ulu Remis Deli dura (ENL48) и Yangambi pisifera (ML161) [13], выращенных в Кота Гелангги, Малайзия.Две родительские ладони не культивировались из-за длительного периода восстановления, ожидаемого после культивирования тканей, что могло бы помешать текущей программе разведения.
Инициирование каллусов и эмбриоидов
Общая схема процесса культивирования ткани описана на рисунке 1. Культура тканей была проведена Советом по пальмовому маслу Малайзии (MPOB) и семью сотрудничающими лабораториями (перечисленными в Благодарностях), каждая из которых культивировала несколько пальм в соответствии со своими возможностями с использованием стандартизированные процедуры.Из каждой пальмы в популяции для картирования отбирали образцы для тканевой культуры путем тщательного сбора неоткрытых листьев копьевидной капусты (листовой капусты), как показано на рисунке S1.
Рисунок 1. Общий рабочий процесс культивирования тканей масличной пальмы. Эксплантат (E0) культивируют для образования каллуса ( C ), который переносят в новую среду (C1) для образования эмбриоидов.
Культуры, не образующие каллуса ( NC ), переносятся на свежую среду ( E1 — E3 ) и снова подвергаются тому же процессу.Эмбриоиды ( EC ), полученные из C1 , переходят в полиэмбриоидную культуру ( PE1 — PE15 ) для регенерации проростков. Культуры каллусов, которые не могут генерировать эмбриоиды ( NEC ), переносятся на свежую среду ( C2 — C4 ) и снова подвергаются тому же процессу.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053076.g001
Удаляли оба конца капусты и ее внешние слои, кроме черешков вайи № 0.Все поверхности были промыты чистым спиртом. За этим последовал продольный разрез, чтобы обнажить внутренние листья (от -3 до -7 или ниже), составляющие стопки молодых листочков. Во избежание загрязнения примерно 10 см на дистальных концах листочков отбрасывали, а оставшиеся листочки разрезали на 12 сегментов шириной примерно 1,5 см. Эксплантаты стерилизовали в следующие этапы: i. погружение в свежеприготовленный раствор гипохлорита кальция (45 г / л) при комнатной температуре на 20 мин, ii.ополаскивание стерильно-дистиллированной водой в течение 10 секунд и iii. погружение в стерильный раствор глюкозы 30 г / л перед культивированием на модифицированной среде Мурашиге и Скуга [15], содержащей одну из двух концентраций альфа-нафталиновой уксусной кислоты (NAA), в дальнейшем именуемых обработками 1 и 2.
При обработке 1 эксплантаты инокулировали при 28 ± 2 ° C в непрерывной темноте в течение трех месяцев в NAA 5 мг / л ( E0 ). Эксплантаты, которые не образовывали каллуса ( NC ), переносили в свежую среду, аналогичную E0, и подвергали тому же процессу при E1 , E2 и E3 .Полученные каллусы переносили в новую среду, содержащую 5 мг / л NAA ( C1 ), для образования эмбриоидов ( EC ). За этим процессом последовали полиэмбриоидные культуры ( PE1 — PE15 ) с 0,1 мг / л NAA. Каждая субкультура PE занимала два месяца при 12-часовом фотопериоде. Культуру каллуса, которая не смогла образовать эмбриоид ( NEC ), переносили в свежую среду, чтобы снова пройти тот же процесс ( C2 — C4 ). Для лечения 2 использовали 10 мг / л NAA для культур эксплантатов и каллусов ( E0 — E3 и C1 — C4 ), затем 0.5 мг / л NAA в PE1 — PE3 и 0,1 мг / л NAA в PE4 — PE15 .
В течение двух лет определяли скорость каллюза (CR) и скорость эмбриогенеза (ER). CR и ER измеряли как: CR = (общее количество каллусов, образованных от E0 до E3 / общее количество чистых культур) × 100,0%; ER = (общее количество образованных эмбриоидных линий от C1 до C4 / общее количество образованных каллусов) × 100,0%. Измерения были обозначены как CR1 и ER1 и CR2 и ER2 для лечения 1 и 2 соответственно.
Экстракция ДНК
Геномная ДНК была извлечена из листьев копья (хранящихся при -80 ° C) 87 потомков и двух родительских пальм с использованием модифицированного метода CTAB [16]. Концентрацию и чистоту ДНК измеряли с использованием спектрометра UV / VIS (Perkin-Elmer Lambda Bio 2.2). Для анализа SSR готовили ДНК при концентрации 50 нг / мкл в буфере ТЕ (pH 8,0).
Анализ SSR
В данном исследовании праймеры SSR были в основном получены из коллекции MPOB SSR масличной пальмы.Дополнительные геномные последовательности праймеров SSR были загружены из базы данных TropGENE (http://tropgenedb.cirad.fr/html/oilpalm_Marker.html) и обозначены как mEgCIR. Собственные SSR MPOB были разработаны из EST масличной пальмы и геномных последовательностей, описанных в [17] — [20]. SSR, полученные из тегов экспрессируемой последовательности E. guineensis, (EST), геномных последовательностей E. guineensis, , геномных последовательностей E. oleifera, и межвидового гибрида ( E. guineensis × E. oleifera), были помечены геномных последовательностей. sEg, sMg, sMo и sMh соответственно.
Скрининг и генотипирование полиморфных SSR проводили, как описано в [19]. Кроме того, генетический анализатор ABI3100 (Applied Biosystems, Великобритания) был использован для ускорения процесса генотипирования с использованием праймеров с хвостом M13, как описано в [21]. Последовательность M13 длиной 19 пар оснований (CACGACGTTGTAAAACGAC) была присоединена к каждому из прямых праймеров (Fwd 5′-M13) и флуоресцентному красителю (HEX- / 6-FAM- / NED-M13). ПЦР проводили в объеме 10,0 мкл, содержащем 100 нг ДНК, 1 × буфер для ПЦР (NEB, США), 2 мМ каждого dNTP (NEB, США), 2.5 мкМ каждого праймера (Fwd 5′-M13, обратный немеченый праймер и праймер краситель-M13) и 0,5 ед. ДНК-полимеразы Taq (NEB, США). ПЦР проводили, как описано в [19]. Каждый из максимум трех продуктов ПЦР был помечен HEX, 6-FAM и NED и мультиплексирован в соотношении 1∶1: 2. Две мкл мультиплексированной смеси денатурировали в 7,84 мкл формамида Hi-Di ™ (Applied Biosystems, Великобритания) и 0,16 мкл GeneScan ™ 400HD ROX® Standard Size (Applied Biosystems, UK). Затем денатурированный образец фрагментировали и определяли размер на генетическом анализаторе ABI3100.
Данные генотипа, полученные в результате анализа SSR, были оценены на основе профилей сегрегации 1, 5, 8 и 9 в [14], которые проиллюстрированы в таблице S1. В профиле 1 полиморфизм локуса наблюдался у любого из родителей. Гетерозиготные и гомозиготные генотипы оценивали как lm и ll для сегрегации аллелей у родителя ENL48 и np и nn для родителя pisifera . Ожидается, что соотношение для генотипов lm : ll и nn : np будет соответствовать соотношению сегрегации 1: 1.В профиле 5 менделевское соотношение сегрегации 1-2: 1 (для комбинации hh : hk : kk ) ожидается, когда два общих аллеля ( h и k ) разделяются у обоих родителей. Профиль 8 показывает три ко-сегрегационных аллеля с одним общим аллелем (с оценкой e ) у обоих родителей и двумя разными аллелями (с оценкой f и g ). Ожидается, что сегрегация этих аллелей ee : ef : , например, : fg , будет в соотношении 1: 1: 1: 1.В конфигурации, где имеется четыре ко-сегрегационных аллеля (профиль 9), два разных аллеля сегрегируются у каждого родителя, и они были оценены как a и b в родительском ENL48 и c и d в родительском ML161. . Ожидается, что генотипы ac : bc : ad : bd будут разделяться в соответствии с соотношением 1: 1: 1: 1.
Анализ RFLP
АнализRFLP проводился в соответствии с [22] с большей частью маркерных данных, полученных из [13], [23].Маркеры были названы в честь различных типов тканей, из которых были получены пробы кДНК. Использовались следующие номенклатуры: CA / CB (неэмбриогенный каллус), CEO (эмбриогенный каллус), EA / EO (пролиферирующий эмбриоид), FDA / FDB / SFB (соцветие), G / GT (молодые этиолированные проростки), K / KD. / KT (ядро), M / ME / MET / MT (мезокарпий) и RD (корень). Оценка маркера RFLP была аналогична SSR.
Анализ AFLP
маркеров AFLP были созданы с использованием трех комбинаций рестрикционных ферментов: Eco RI / Mse I, Pst I / Mse I и Taq I / Hind III, как описано в [13], [23] ].Номенклатура маркеров представляет собой пару селективных праймеров, за которой следует размер наблюдаемого фрагмента. Данные оценивали для полиморфных фрагментов, как в профиле 1 (таблица S1).
Анализ генотипических данных и построение карт родительского сцепления
Данные SSR были включены в предыдущие наборы родительских данных, состоящие из маркеров RFLP и AFLP. Анализ хи-квадрат был выполнен для определения маркеров с искаженной сегрегацией на нескольких уровнях от P <0,0001 до <0.1. Маркеры, показывающие искаженную сегрегацию и отсутствующие данные, были исключены в соответствии с критериями [24]. В этом исследовании стратегия картирования заключалась в том, чтобы систематически исследовать данные маркеров, тем самым удаляя проблемные маркеры на каждом этапе процесса построения карты.
Анализ сцепления проводили отдельно для ENL48 и ML161 с использованием JoinMap® 4.0 [25]. Все маркеры (кроме маркеров с типом сегрегации
Маркеры типа сегрегации
Статистический анализ
CR был преобразован с использованием логарифмического преобразования { ln (CR +0,2)}, впоследствии обозначенного как LnCR. Примерно половина наблюдаемых ER были равны нулю. Поэтому использовались два преобразования: (1) преобразование в двоичную переменную, обозначенную как binER, со значениями: 0, если ER = 0, и 1, если ER> 0, (2) преобразование в порядковую переменную, обозначенную как ordER, с тремя значениями: 0, если ER = 0, 1, если 0
Следующий анализ был проведен на основании того факта, что пальмы случайным образом были распределены по восьми лабораториям. Различия между лабораториями и обработками были устранены с помощью смешанной модели: y ijk = µ + l i + t j + p ik + e , в котором y ijk — это наблюдение на ладони k (= 1… n j ), присвоенное лаборатории i (= 1… 8) с обработкой j (= 1, 2), l i — фиксированный эффект лаборатории i , t j — фиксированный эффект лечения j , p ik — случайный эффект ладони k внутри лаборатории i (с нулевым средним и дисперсией σ p 2 ) и e ijk является остаточным эффектом (с нулевым средним и дисперсией σ e 2 ).Оценка параметров проводилась с использованием средств REML в GenStat 14 [29]. Предсказания случайных эффектов p ik , обозначенные как PLnCR, PbinER и PordER, соответственно, подвергали анализу QTL. Коэффициент детерминации был рассчитан как σ p 2/ ( σ p 2 + σ e 2 ) с параметрами, замененными оценками; коэффициент детерминации — это мера сходства наблюдений в вариантах лечения 1 и 2.
Обнаружение локусов количественных признаков (QTL)
Выявление QTL проводили с использованием библиотеки GenStat QTL [29]. Признаки PLnCR и PbinER, а также PLnCR и PordER были подвергнуты анализу QTL по двум признакам. Тесты на значимость QTL проводились только в положениях маркеров. Для определения порога значимости использовался метод Ли и Цзи [30] с полногеномным уровнем значимости 95,0%. Окончательный выбор QTL был получен после картирования MQM и обратного удаления предполагаемого QTL.
Результаты
Фенотипирование и оценка данных каллогенеза и эмбриогенеза
В культуре ткани каждой пальмы приблизительно равное количество эксплантатов было воспроизведено для культивирования в вариантах 1 и 2. Исключение составляла ладонь номер 87, у которой разница между двумя повторностями составляла 92 эксплантата, и пальма 75, которая не подходила для отбора образцов. в период исследовательской программы. Количество реальных эксплантатов для каждой пальмы варьировалось от 412–1158 в зависимости от количества внутренних листков, доступных для культивирования тканей.
Высокий разброс CR наблюдался при лечении 1–0–47,2% и при лечении 2–0,14–41,7%. Для ER, который был рассчитан как общее количество эмбриоидов, сформированных из каллусов, варьировалось от 0–21,1% в варианте 1 и 0–45,2% в варианте 2 (рисунок S2). Коэффициент детерминации CR был равен 0,94, что свидетельствует о высоком уровне сходства значений двух обработок. Для ER коэффициент детерминации был равен 0,48 для двоичной оценки (binER) и 0,51 для порядковой оценки (ordER) с тремя категориями, показывая промежуточный уровень сходства.
В этом исследовании данные каллюсии и эмбриогенеза были получены в восьми различных лабораториях с двумя разными методами лечения. Поэтому был проведен дальнейший анализ, чтобы определить, влияют ли эти экспериментальные переменные на фенотипические данные. В таблице 1 представлены результаты анализа смешанной модели. Эта таблица показывает, что между лабораториями наблюдаются большие и существенные различия. Однако не было обнаружено значительных различий между методами лечения. Для анализа QTL использовались прогнозы LnCR, binER и ordER для отдельных ладоней (после удаления эффектов обработок и лабораторий), полученные из анализа смешанной модели.Прогнозы были обозначены как PLnCR, PbinER и PordER соответственно. В таблице 2 приведены способы каллусинга (LnCR) и скорости эмбриогенеза (binER и ordER).
Данные SSR
В этом исследовании всего 342 полиморфных SSR были сгенерированы из коллекции последовательностей в MPOB (sEg, sMg, sMo и sMh) и общедоступной базе данных (mEgCIR). SSR были оценены на предмет полиморфизма на основе профилей [14], где 252 (81 в ENL48, 171 в ML161), 20, 49 и 21 SSR были оценены как имеющие профили 1, 5, 8 и 9 соответственно.В ENL48 полиморфные SSR состояли из 55 mEgCIR, 27 sMg, 50 sMg и 39 sMo, тогда как в ML161 265 SSR состояли из 86 mEgCIR, 42 sEg, 75 sMg, 61 sMo и 1 sMh. Из них большинство SSR сегрегировалось у одного из родителей, а 26,3% были полиморфными как в ENL48, так и в ML161.
Впоследствии данные SSR были объединены с существующими наборами данных RFLP и AFLP для создания генетической карты родительских ладоней. Ранее мы сгенерировали 152 AFLP и 102 RFLP для ENL48 и 272 AFLP и 165 RFLP для ML161, включая данные, представленные в [13].Количество маркеров каждого типа, используемых для построения карты, сведено в Таблицу S2.
Родительские карты ENL48 и ML161
С добавлением маркеров SSR количество маркеров в ENL48 увеличилось до 425 (152 AFLP, 102 RFLP и 171 SSR) и 702 (272 AFLP, 165 RFLP и 265 SSR) в ML161. В ENL48 55 маркеров (49 AFLP и 6 RFLP) с отсутствующими данными ≥10,0% и 12 маркеров (9 AFLP, 1 RFLP и 2 SSR) с серьезным нарушением сегрегации (p <0,0001) были исключены из дальнейшего анализа.Большинство оставшихся искаженных маркеров показали искаженную сегрегацию при p <0,05–0,1 и менее 10,0% при p <0,0005–0,01. Сходные критерии также использовались для изучения набора данных ML161, из которого было исключено 94 маркера (83 AFLP, 6 RFLP и 5 SSR). После удаления сильно искаженных маркеров при p <0,0001 процент искажения, наблюдаемый в ML161, составил около 2,0%, что значительно ниже, чем (18,0%) в ENL48.
Наконец, набор данных, использованный для построения карты связей ENL48, состоял из 94 AFLP, 95 RFLP и 169 SSR.Из 358 проанализированных маркеров 330 были объединены в 23 группы. Чтобы определить наилучшее положение для каждого маркера в группе связей, также были определены и удалены маркеры, способствующие недостаточным связям. Окончательная карта состояла из 148 маркеров (33 AFLP, 38 RFLP и 77 SSR) в 23 группах (Рисунок 2). Последовательности праймеров SSR и клонов RFLP, картированные в этом исследовании, были депонированы в общедоступные базы данных с их номерами доступа, показанными в таблицах 3 и 4.
Рисунок 2.Выравнивание карт ENL48 (слева) и ML161 (справа) с использованием совмещающих маркеров.
Маркеры, показывающие искаженную сегрегацию, обозначены звездочкой (*), представляющей значимость при p <0,1; (**) р <0,05; (***) p <0,01; (****) p <0,05 и; (******) p <0,0005.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053076.g002
Отдельные группы связей были связаны с картой, опубликованной [14], с использованием маркеров mEgCIR. Например, mEgCIR0268, mEgCIR3813 и mEgCIR3809 из LG1 в [14] также были картированы в ENL48, и группа сцепления, обозначенная таким образом, LGD1 (где «LG» представляет группу сцепления, а «D» dura ).В некоторых случаях маркеры, о которых [14] сообщил, что они принадлежат к одной группе сцепления, были разделены в ENL48. Например, маркеры mEgCIR3693, mEgCIR3477 и mEgCIR3557 были картированы в LG4 [14], однако в этом исследовании маркер mEgCIR3693 находился в отдельной группе от mEgCIR3477 и mEgCIR3557. В этом сценарии две группы сцепления рассматривались как две подгруппы для LGD4 и обозначены как LGD4a и LGD4b. Полученная в результате каркасная карта покрывала общее генетическое расстояние 798,0 сМ со средним значением 5,4 сМ между маркерами.
Что касается ML161, из 608 проанализированных маркеров 27 были разгруппированы, а 341 нельзя было уверенно позиционировать на карте. Остальные 50 AFLP, 71 RFLP и 119 SSR были распределены в 24 группы. По сравнению с ENL48, для ML161 была построена более плотная карта с 240 маркерами, охватывающая общую длину карты 1328,6 см при средней плотности 5,5 см между маркерами. Подобно ENL48, группы сцепления были обозначены соответственно «P», представляющим pisifera . Стабильность порядка маркеров была продемонстрирована коллинеарностью маркеров mEgCIR по сравнению с маркерами [14].Были идентифицированы шестнадцать групп сцепления, которые также представляют основное количество пар хромосом в масличной пальме, и они обозначены как LGP1 — LGP16.
Получившаяся карта ML161 использовалась в качестве второй справочной карты для карты ENL48 с использованием совмещенного SSR (из базы данных MPOB) и маркеров RFLP. Это было особенно полезно для связывания групп между двумя родительскими картами, особенно для тех, у которых не было ни одного маркера mEgCIR или только с одним маркером, например LGD3, D4a, D5, D7, D10a, D10b, D11a, D11c, D12b, D13, D15 и D16.Используя этот подход, выравнивание групп сцепления между двумя родительскими картами было определено и представлено на рисунке 2, что значительно упрощает сравнение положений маркеров в соответствующих группах сцепления в ENL48 и ML161.
Всего на картах ENL48 и ML161 было нанесено на карту 53 ко-сегрегационных маркера (16 RFLP и 37 SSR). Теоретически интеграция карты возможна как минимум с двумя общими маркерами совместного разделения в группе. Это будет означать, что большинство групп на двух родительских картах (D1 / P1, D2 / P2a, D3 / P3, D4a / P4a, D4b / P4b, D5 / P5a, D7 / P7, D8b / P8b, D10a / P10, D11a / P11a, D11c / P11b, D12b / P12b, D13 / P13, D15 / P15 и D16 / P16b) могут быть интегрированы.Однако наш опыт в этом исследовании показал, что количество ко-сегрегационных маркеров было недостаточным для точного объединения двух родительских карт. Было замечено, что почти во всех интегрированных группах (данные не представлены) различия в частотах рекомбинации между родителями были высокими (0,3–0,5). Это может быть связано с редкостью маркеров в одной из родительских групп сцепления (в данном случае в основном на карте ENL48).
QTL, связанный с ответом на культуру ткани
Были обнаружены два QTL: каждый для каллогенеза (PLnCR) и эмбриогенеза (PordER).Как показано на рисунке 3, QTL для PLnCR был обнаружен в LGD4b ENL48 в нулевой позиции. Маркер, указывающий на QTL, был mEgCIR3477 и объяснял 17,5% дисперсии; эффект замещения аллеля составил 0,048 (S.E = 0,012). Также было обнаружено, что маркер оказывает незначительное влияние (0,014 ± 0,006) на PordER, объясняя 5,7% дисперсии. Гораздо более важный эффект QTL для PordER был обнаружен в LGP16b в ML161. QTL находится на 26,34 сМ (маркер sMo00109) и объясняет 20,1% дисперсии; эффект замещения аллеля составил 0.027 (S.E = 0,006).
Рис. 3. QTL, обнаруженные для PLnCR и PordER с использованием анализа QTL с несколькими признаками, GenStat 14.
Верхняя панель показывает профили QTL при –log10 (P-значение), которые являются результатом сканирования интервального картирования. Горизонтальная линия показывает порог значимости для всего генома, определенный Li и Ji (P = 3,5). Нижняя панель показывает эффекты QTL (зеленый квадрат), возникающие в результате взаимодействий с несколькими признаками: QTL на LGD4b подвергался влиянию PLnCR (темно-синий квадрат) и PordER (голубой квадрат) while; QTL на LGP16b содержит только эффект от PordER (коричневый квадрат).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053076.g003
Обсуждение
Составление карты населения
Скрещивание с пальмами dura и pisifera дает гибрид tenera s, который в настоящее время используется в качестве коммерческого посадочного материала. Поэтому они имеют первостепенное значение для индустрии масличных пальм. Популяция для картирования, использованная в этом исследовании, представляла собой уже существующую популяцию, включающую помесь Ulu Remis Deli dura (ENL48) и Yangambi pisifera (ML161).Известно, что пальмы Deli dura с генетическим фоном Ulu Remis хорошо сочетаются с Yangambi pisifera s, давая высокопродуктивное потомство tenera [31]. Несколько ладоней из этого скрещивания ранее культивировали ткани и показали вариации в ответ на культивирование ткани. Таким образом, это скрещивание высокоурожайных tenera s было сочтено подходящим для определения QTL для пригодности культуры ткани.
Культура тканей исследуемой популяции
Высота масличной пальмы делает отбор образцов ее молодых листьев для культивирования сложной задачей.Процесс требует от квалифицированных рабочих, чтобы подняться на пальму и собрать очень молодые листья копья, которые еще даже не прорастали, не повреждая апикальную точку роста. Из-за устойчивого повреждения повторный забор пальмы возможен только через три-пять лет [32]. Таким образом, повторная выборка пальм была невозможна в сроки исследовательского проекта. Образцы родительских пальм не отбирались, поскольку они активно использовались в программе разведения, и было нецелесообразно ждать по крайней мере три года, пока пальмы не восстановятся.Кроме того, было желание избежать риска необратимого повреждения ладоней.
Большинство пальм было невосприимчивым к культуре тканей, как и следовало ожидать из предыдущего опыта выращивания масличных пальм во всем мире. О значительном отклонении данных об удобстве культур тканей от нормального распределения также часто сообщалось для других культур, таких как красный клевер [7], пшеница [11], рис [10], ячмень [12], сосна лоблолли [33] и данные должны были быть преобразованы для нормальности. В самом деле, нормальность не может быть получена даже после трансформации, как, например, в случае данных о скорости дифференцировки побегов у ячменя [34], образовании каллуса у кукурузы [35] и индукции каллуса и соматическом эмбриогенезе у ржи [36].Таким образом, в этих исследованиях для анализа QTL использовались ненормальные данные. В текущем исследовании мы улучшили нормальность CR и ER в два этапа (как описано в «Материалы и методы» ), включая преобразования и коррекцию экспериментальных переменных до анализа QTL.
Разработка дополнительных маркеров SSR
SSR были разработаны как из EST, так и из геномных библиотек масличной пальмы. О разработке этих SSR ранее сообщалось в [17] — [20], [37].Авторы (кроме [17]) выбрали некоторые SSR для исследований генетического разнообразия, и это исследование сообщает об их применимости для генетического картирования и анализа QTL. Хотя большое количество SSR было зарегистрировано из существующих коллекций последовательностей масличной пальмы, ожидается, что это число быстро возрастет в результате проекта секвенирования генома, выполняемого для масличной пальмы [38]. Также нет сомнений в том, что со временем для масличной пальмы также станет доступно большое количество маркеров однонуклеотидного полиморфизма (SNP).
Дополнительные сегрегационные маркеры SSR, использованные в этом исследовании, имеют решающее значение для дальнейшего насыщения и интеграции обеих родительских карт. Выбранный подход заключался в том, чтобы сосредоточиться на SSR, а не на RFLP, которые, как известно, имеют низкую пропускную способность и являются дорогостоящими. SSR, происходящие из EST, по существу аналогичны зондам RFLP кДНК, поскольку они также происходят из генных областей. Таким образом, подход был подходящим, поскольку EST-SSRs выявили больше когрегированных маркеров (около 38,0%), чем 24,4%, полученные с помощью RFLP. Ранее [14] показали потенциальное использование геномных SSR-маркеров для интеграции карт tenera и dura .В этом исследовании также использовались геномные SSR, которые внесли разумное количество ко-сегрегированных маркеров — около 35,0% от общего количества геномных SSR, генотипированных. Следовательно, существует потенциал использования SSR, полученных как из EST, так и из генома, для насыщения карты и интеграции, как это было замечено в этом исследовании.
Карты генетической связи масличной пальмы
Текущие карты были построены с использованием очень строгих параметров (как описано в Материалы и методы ). Маркеры (в основном AFLP), о которых сообщалось в [13], которые не соответствовали критериям, были исключены из анализа.Их удаление привело к тому, что некоторые группы, о которых сообщалось ранее, например группа 3 в ML161, были разделены на две подгруппы, теперь обозначенные как P4a и P4b. Подобные изменения наблюдались в группах 7 (теперь обозначенных как подгруппы P2a и P2b), 10 (подгруппы P5a и P5b) и 15 (подгруппы P11a и P11b). Значительные изменения наблюдались также в группах 1 и 2 из [13], которые были разделены на 3–4 подгруппы. Однако большинство групп — 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13 и 16 — остались нетронутыми и были переименованы в LGP1, P10, P13, P7, P15, P12b, P16a, P14 и P16b соответственно. в соответствии с [14].Изменения были также очевидны на карте ENL48. Хотя текущие карты ENL48 и ML161 имеют больше групп, они значительно улучшены в точности порядка маркеров.
Картирование опубликованных маркеров SSR (mEgCIR) позволило провести сравнение с опубликованной генетической картой масличной пальмы. Это, в свою очередь, позволило пометить группы связей на текущей карте, чтобы они соответствовали [14]. Что еще более важно, сравнивая с 16 группами сцепления, описанными в [14], можно идентифицировать группы сцепления, принадлежащие одной и той же хромосоме.Порядок общих маркеров также был сравнен и оказался согласованным, что повысило уверенность в генетических картах, построенных в этом исследовании. Это также позволило стандартизировать маркировку каждой группы связей как в ENL48, так и в ML161, что также значительно упростило сравнение между двумя родительскими картами.
Размер генома для E. guineensis оценивается как 2C = 3,86 ± 0,26 пг [39], что эквивалентно 1887,54 ± 127 Мбит / с (количество пар оснований = масса в пг × 0,978 × 10 9 , где 1 .0 пг = 978 Мбит [40]). Если рассматривать оценки как эталонные, карта ML161 (1328,6 см) имеет покрытие генома 70,4%, а ENL48 (798 см) — 42,3%. Предполагаемый охват генома согласуется с плотностью маркеров, наблюдаемой на двух родительских картах. Между маркерами в одной и той же хромосоме все еще наблюдались разрывы> 20,0 см. Дополнительные маркеры SSR (и, возможно, SNP) необходимы для насыщения двух родительских карт. Это также полезно для дальнейшего уменьшения количества групп сцепления до основного числа хромосом, равного 16.Это было бы особенно сложно для ENL48, потому что его геном кажется более гомозиготным, чем геном ML161. Фактически, родительский образец dura был примерно на 28,0% менее полиморфным, чем pisifera . Вероятно, это связано с узким генетическим фоном ENL48, который представляет собой Deli dura . В целом известно, что материалы Deli dura демонстрируют меньшее разнообразие по сравнению с другими источниками E. guineensis [19]. Кроме того, в программах разведения масличной пальмы материнские линии dura проходят как самоопыление, так и сиббинг для повышения гомозиготности перед скрещиванием с отцовской пальмой pisifera .Таким образом, неудивительно, что ENL48 был более гомозиготным, чем отцовская ладонь (ML161). Следовательно, для насыщения карты ENL48 необходимо отсеивать большее количество SSR и, возможно, SNP.
QTL, ассоциированные с темпами каллусирования и эмбриогенеза
В этом исследовании количество QTL, обнаруженных для ответа на культуру ткани, находится в пределах диапазона, описанного для риса, ячменя, пшеницы, кукурузы, подсолнечника, Arabidopsis , брокколи, тополя и томатов [41]. Тип и размер картирующей популяции входят в число факторов, которые, как полагают, влияют на количество и эффекты обнаруженных QTL.В идеале скрещивание двух ладоней, показывающих крайние различия в культивируемости тканей, было бы более эффективным для обнаружения QTL, связанного с ответом культуры ткани. Однако проблемы, особенно касающиеся доступности пальмовых материалов, ограничивали наши возможности при выборе картографической популяции для изучения. Что касается размера популяции для картирования, сложность культивирования тканей масличной пальмы не позволила бы использовать слишком много пальм. 87 ладоней, использованных в этом исследовании, уже проверили пределы задействованных лабораторий по культивированию тканей.
Существующие лаборатории тканевых культур в Малайзии регулярно выращивают масличные пальмы. Количество пальм и различные культивируемые генотипы могут позволить провести анализ ассоциации маркеров с возможностью культивирования тканей. Это может позволить проверить существующие маркеры, связанные с QTL, для CR и ER и / или позволить выявить дополнительные QTL. Однако, прежде чем это станет возможным, необходимо будет разобраться в стандартизации сбора фенотипических данных и влиянии различных сред, используемых различными лабораториями на CR и ER.
Было высказано предположение, что только несколько просто наследуемых генов имеют большое значение в генетике эмбриогенеза [35]. В масличной пальме также проводились исследования экспрессии генов во время эмбриогенеза. Фактически, некоторые интересные гены, такие как белки-переносчики липидов, были обнаружены в высокой степени экспрессии в эмбриогенных тканях масличной пальмы [17]. У других сельскохозяйственных культур гены, реагирующие на ауксин и раны, такие как ДНК-связывающие белки, кальций-модулированные белки, гены, связанные с клеточным циклом, белки клеточной стенки и глутатион-S-трансфераза, также были связаны с культурой тканей [42] .Следовательно, будет полезно изучить некоторые из идентифицированных генов-кандидатов для картирования на текущих картах. Было бы интересно посмотреть, могут ли маркеры-кандидаты быть сопоставлены ближе к существующим QTL или могут обнаруживать дополнительные QTL.
Применение QTL для улучшения культуры тканей масличной пальмы
В идеале маркер-QTL следует оценивать в других независимых скрещиваниях масличной пальмы. Это было сделано для ячменя с общими QTL, связанными с ростом каллуса, обнаруженными в четырех популяциях [12].Хотя это будет сложная задача, маркеры, связанные с QTL в этом исследовании, могут быть использованы для определения того, обнаруживают ли они такие же QTL в других популяциях масличных пальм.
При условии подтверждения QTL в других картированных популяциях или генотипах они могут быть важны для выбора ортетов для культивирования. В отличие от выраженных признаков (например, урожайности и высоты), пригодность культуры тканей остается неизвестной до тех пор, пока пальмы не будут фактически клонированы. Более того, некоторые высокоурожайные пальмы временами не культивировались.Наличие маркеров, связанных с культивированием тканей, может облегчить клонирование таких ладоней, где благоприятные аллели могут быть включены в потомство этих ладоней посредством селекции с помощью маркеров (MAS), а потомства затем клонированы. Поскольку маркеры урожайности становятся доступными для масличной пальмы [43], можно выбирать пальмы, которые не только являются высокоурожайными, но и поддаются культивированию тканей. Фактически, большая зародышевая плазма масличной пальмы MPOB может быть проверена на наличие подходящих аллелей для урожайности и культуры ткани, прежде чем какие-либо пальмы будут включены в программу разведения.[6] высказали мнение, что самым большим преимуществом клона является раннее использование нового генетического материала, полученного путем внедрения полезного гена от широких скрещиваний, что также поможет расширить генетическую базу нынешнего посадочного материала.
Хотя производство клонов масличной пальмы увеличилось, это больше связано с увеличением количества лабораторий, участвующих в борьбе, чем с реальным улучшением процесса культивирования тканей [6]. Таким образом, сохраняется необходимость в улучшении процесса, чтобы, по крайней мере, удовлетворить больший спрос.В этой работе могут оказаться полезными маркеры, связанные с QTL для культивирования тканей. Пальмы, идентифицированные для клонирования (на основании благоприятных признаков, таких как высокая урожайность или устойчивость к болезням), можно сначала проверить с помощью маркеров, чтобы выяснить, есть ли у них благоприятные аллели для культивирования тканей. Это может помочь сократить время и другие ресурсы, потраченные на культивирование тканей непокорных ладоней.
Дополнительная информация
Рисунок S1.
Отбор образцов неоткрытых листьев копьевидных растений и эксплантатов, используемых для культивирования тканей масличной пальмы. На рисунках A и B показаны квалифицированные рабочие, поднимающиеся по ладони, чтобы срезать неоткрытые листья копья с верхушечной точки роста; C: Внешние слои листовой капусты удаляются, за исключением черешков вайя номер 0. Затем следует продольный разрез, чтобы обнажить внутренние листы (листы от -3 до -7 или ниже), составляющие стопки молодых листочков. D. Листочки разрезают на 12 сегментов, каждый шириной 1,5 см, и стерилизуют перед культивированием на модифицированных средах Murashige и Skoog [15].
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053076.s001
(TIF)
Рисунок S2.
Распределение фенотипических данных для скорости каллусирования (CR) и скорости эмбриогенеза (ER) в вариантах лечения 1 и 2. Нормальность CR1 и CR2 была улучшена преобразованием ln (CR +0,2) и получением набора предсказанных данные (PLnCR). Это было сделано после удаления экспериментальных эффектов дисперсии, которые были получены с помощью анализа компонентов дисперсии REML. Для ER использовались два преобразования: (1) преобразование в двоичную переменную, обозначенную как binER, со значениями: 0, если ER = 0, и 1, если ER> 0, (2) преобразование в порядковую переменную, обозначенную как ordER , с тремя значениями: 0, если ER = 0, 1, если 0
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053076.s002
(TIF)
Благодарности
Авторы выражают благодарность генеральному директору MPOB за разрешение опубликовать эту статью. Мы также хотели бы поблагодарить специалистов по культивированию тканей из различных агентств масличных пальм, а именно, доктора Хамида Мусу (и ее предшественницу, доктора Залеху Мохд Мидин) и г-жу Халину Мохд Рамли из Guthrie Biotech Laboratory Sdn Bhd; ДокторМахеран Абу Бакар и г-н Ав Хо Тенг из FELDA Agricultural Services Sdn Bhd; Д-р Лим Лун Луи из IOI Corporation Bhd; Г-жа Хо Юк Ва, ранее работавшая в United Plantations Bhd; Д-р Азия Мохд Юсофф и г-жа Халила Хафидз из компании Golden Hope Plantations Bhd; Г-жа Сузайни Яхья из лабораторий Эбор; и г-же Гирли Вонг и г-жи Джойс Чонг из компании Applied Agriculture Research Sdn Bhd за их поддержку в культивировании тканей ладоней. Guthrie Biotech Laboratory Sdn Bhd, Golden Hope Plantations Bhd и Ebor Laboratories теперь являются частью Sime Darby Berhad.Мы также хотели бы выразить нашу признательность г-ну Сухайми Шамсуддину, селекционеру масличных пальм в FELDA, за его помощь в поддержании кросса и взятии образцов с пальм. Часть работы, приведшей к этой статье, была проведена в Biometris, Вагенингенском университете и исследовательском центре, Нидерланды. Мы хотели бы поблагодарить доктора Азхара Мохамада за его доброту, позволившую нам использовать генетический анализатор ABI3100 (Applied Biosystems, Великобритания) в Ядерном агентстве Малайзии. Мы также хотели бы выразить нашу признательность господину А.Энди Квонг Чунг Чанг за ценные комментарии к рукописи.
Вклад авторов
Задумал и спроектировал эксперименты: NCT JJ ZI CWC SCC SGT RS. Выполнял эксперименты: NCT JN. Проанализированы данные: NCT JJ RS. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: ZI CWC JJ RS. Написал статью: NCT JJ JN SGT RS.
Ссылки
- 1. Хо Ю.В., Тан С.К., Сох А.С., Вонг Дж., Вонг С.П. и др. (2009) Масличная пальма для процветания фермеров и безопасности пищевых масел.Proc Национальная конференция по масличной пальме. Индия: 86–93.
- 2. Hardon JJ, Corley RHV, Lee CH (1987) Селекция и отбор масличной пальмы. В: Настоятель А.Дж., Аткин Р.К., ред. Улучшение вегетативно размножаемых культур. Лондон: Academic Press. 63–81.
- 3. Corley RHV, Law IH (1997) Будущее клонов масличной пальмы. Proc Int. Planters Conf. Incorp. Soc. Куала-Лумпур: 279–289.
- 4. Корли Р.Х., Стратфорд Р. (1998) Биотехнология и масличная пальма: возможности и будущее влияние.Proc Int. Oil Palm Conf. Бали: 1–19.
- 5. Тармизи А.Х., Замзури И., Оои С.Е., Самсул К.Р., Чан П.Л. и др. (2010) Продвижение вперед с клонами. В: Басри М.В., Чу Ю.М., Чан К.В., редакторы. Дальнейшие достижения в исследованиях масличных пальм. Банги: Малазийский совет по пальмовому маслу. 102–140.
- 6. Soh AC, Wong G, Tan CC, Chew PS, Chong SP и др. (2011) Размножение и посадка элитных клонов масличной пальмы в промышленных масштабах: исследования и разработки в направлении реализации. Журнал исследований масличной пальмы 23: 935–952.
- 7. Киз Г.Дж., Коллинз Г.Б., Тейлор Н.Л. (1980) Генетическая изменчивость в тканевой культуре клевера лугового. Theor Appl Genet 58: 265–271.
- 8. Кушайри А., Тармизи А.Х., Замзури И., Онг-Абдулла М., Самсул К.Р. и др .. (2010). Производство, производительность и достижения в культуре тканей масличной пальмы. Доклад, представленный на Международном семинаре по достижениям в культивировании тканей масличной пальмы. Джокьякарта.
- 9. Wooi KC (1995) Культура тканей масличной пальмы: текущая практика и ограничения.Материалы Международного симпозиума 1993 г. по последним достижениям в культуре тканей масличной пальмы и биотехнологии. Банги: 21–32.
- 10. Taguchi-Shiobara F, Lin SY, Tanno K, Komatsuda T., Yano M, et al. (1997) Картирование локусов количественных признаков, связанных со способностью к регенерации каллуса семян риса, Oryza sativa L. Theor Appl Genet. 95: 828–833.
- 11. Ben Amer IM, Korzun V, Worland AJ, Börner A (1997) Генетическое картирование QTL, контролирующих ответ тканевой культуры на хромосоме 2B пшеницы ( Triticum aestivum L.) по отношению к основным генам и маркерам RFLP. Theor Appl Genet 94: 1047–1052.
- 12. Mano Y, Komatsuda T (2002) Идентификация QTL, контролирующих признаки культуры тканей ячменя ( Hordeum vulgare L.). Theor Appl Genet 105: 708–715.
- 13. Тинг NC, Cheah SC, Zamzuri I, Tan SG, Faridah QZ и др. (2006) Статистическое картирование локусов количественных признаков, контролирующих время до первого каллуса у масличной пальмы ( Elaeis guineensis Jacq.) культура ткани. Pertanika J Trop Agric Sci 29 (1 и 2): 35–45.
- 14. Billotte N, Marseillac N, Risterucci AM, Adon B, Brottier P и др. (2005) Карта связей высокой плотности в масличной пальме на основе микроспутников ( Elaeis guineensis Jacq.). Theor Appl Genet 110: 754–765.
- 15. Murashige T, Skoog F (1962) Пересмотренная среда для быстрого роста и биологических анализов с культурами тканей табака. Physiol. Растение. 15: 473–497.
- 16. Дойл Дж. Дж., Дойл Дж. Л. (1990) Выделение растительной ДНК из свежей ткани.ФОКУС 12: 13–15.
- 17. Low ETL, Halimah A, Boon SH, Elyana MS, Tan CY, et al. (2008) Масличная пальма ( Elaeis guineensis Jacq.) EST культуры ткани: идентификация генов, связанных с каллогенезом и эмбриогенезом. BMC Plant Biology 8: 62.
- 18. Сингх Р., Норариза М.З., Тинг Н.К., Розана Р., Тан С.Г. и др. (2008) Использование базы данных EST масличной пальмы для разработки генных маркеров SSR и их использования для оценки генетического разнообразия.Биология 63 (2): 1–9.
- 19. Тинг NC, Noorhariza MZ, Rozana R, Low ETL, Maizura I и др. (2010) Разработка SSR в базе данных EST масличной пальмы: применение в исследованиях разнообразия зародышевой плазмы масличной пальмы. Журнал генетики 89: 135–145.
- 20. Noorhariza MZ, Ismanizan I, Rozana R, Ting NC, Singh R (2010) Разработка и характеристика микросателлитных маркеров Elaeis oleifera . Sains Malaysia 39 (6): 909–912.
- 21. Boutin-Ganache I, Raposo M, Raymond M, Deschepper CF (2001) Праймеры с хвостом M13 улучшают читаемость и удобство использования микросателлитных анализов, выполняемых с помощью двух различных методов определения размера аллелей.Биотехнологии 31: 24–28.
- 22. Cheah SC, Сити Нор Акмар A, Ooi LCL, Rahimah AR, Maria M (1993) Обнаружение изменчивости ДНК в масличной пальме с использованием зондов RFLP. Материалы Международной конференции по пальмовому маслу PORIM 1991 г. — сельское хозяйство. Банги: 144–150.
- 23. Chua KL (2006) Создание карт генетического сцепления RFLP и AFLP для масличной пальмы ( Elaeis guineensis Jacq.) С использованием кросса Deli dura X Yangambi pisifera . Тезис.
- 24.Сингх Р., Тан С.Г., Панандам Дж. М., Рахима А.Р., Ooi LCL и др. (2009) Картирование локусов количественных признаков (QTL) для состава жирных кислот в межвидовом скрещивании масличной пальмы. BMC Plant Biology 9: 114.
- 25. Van Ooijen JW (2006) JoinMap®4.0: программное обеспечение для расчета карт генетического сцепления в экспериментальных популяциях. Kyazma B.V., Вагенинген, Нидерланды.
- 26. Jansen J (2005) Построение карт сцепления в полнокровных семьях диплоидных аутбридинговых видов путем минимизации количества рекомбинаций в векторах скрытого наследования.Генетика 170 (4): 2013–2025.
- 27. Grattapaglia D, Sederoff RR (1994) Карты генетического сцепления Eucalyptus grandis и Eucalyptus urophylla с использованием стратегии псевдотестового картирования и маркеров RAPD. Генетика 137: 1121–1137.
- 28. Voorrips RE (2002) MapChart: программное обеспечение для графического представления карт связей и QTL. J. Hered 93 (1): 77–78.
- 29. VSN International (2011) GenStat для windows 14 th edition.VSN International, Хемел Хемпстед, Великобритания. Веб-страница: GenStat.co.uk.
- 30. Li J, Ji L (2005) Регулировка множественного тестирования в мультилокусном анализе с использованием собственных значений корреляционной матрицы. Наследственность 95: 221–227.
- 31. Чин К.В., Сухайми С. (1996) Посадочные материалы масличных пальм FELDA. Proc Посадочные материалы масличной пальмы для местных и зарубежных предприятий. Банги: 71–90.
- 32. Сайед Алви ССР, Рови С.Х., Ав К.Т., Осман А.З. (2010) Развитие культуры тканей масличной пальмы в Фельде и его проблемы.Proc Достижения в культуре тканей масличной пальмы. Джокьякарта: 45–52.
- 33. MacKay JJ, Becwar MR, Park Y-S, Corderro JP, Pullman GS (2006) Генетический контроль инициации соматического эмбриогенеза у долькой сосны и значение для разведения. Генетика деревьев и геномы 2: 1–9.
- 34. Komatsuda T, Annaka T, Oka S (1993) Генетическое картирование локуса количественных признаков (QTL), который увеличивает скорость дифференциации побегов в Hordeum vulgare L. Theor Appl Genet.86: 713–720.
- 35. Краковский М.Д., Ли М., Гарай Л., Вудман-Кликеман В., Лонг М.Дж. и др. (2006) Локусы количественных признаков для инициации каллуса и тотипотентности у кукурузы ( Zea mays L.). Theor Appl Genet 113: 821–830.
- 36. Bolibok H, Grusczynska A, Hromada-Judycka A, Rakoczy-Trojanowska M (2007) Идентификация QTL, связанных с ответом in vitro ржи ( Secale cereal L.). Письма о клеточной и молекулярной биологии 12: 523–535.
- 37. Сингх Р., Мария М., Низкий ETL, Оои-Лесли К.Л., Чан П.Л. и др .. (2011) Геномика масличной пальмы: основа для повышения продуктивности сельского хозяйства. В: Басри М.В., Чу Ю.М., Чан К.В., редакторы. Дальнейшие достижения в исследованиях масличных пальм (2000–2010 гг.). Банги: Малазийский совет по пальмовому маслу. 202–251.
- 38. Mohd Basri W (2009) Секвенирование генома масличной пальмы: начало. Доклад представлен на Международном конгрессе масличной пальмы (PIPOC). Куала Лумпур.
- 39. Madon M, Phoon LQ, Clyde MM, Mohd Din A (2008) Применение проточной цитометрии для оценки содержания ядерной ДНК в Elaeis .J. Исследование масличной пальмы 20: 447–452.
- 40. Долезел Дж., Бартос Х., Фоглмайр Дж., Грейлхубер Дж. (2003) Содержание ядерной ДНК и размер генома форели и человека. Цитометрия 51A (2): 127–128.
- 41. Bolibok H, Rakoczy-Trojanowska M (2006) Генетическое картирование QTL для ответа на культуру ткани у растений. Euphytica 149: 73–83.
- 42. Онг-Абдулла М., Оои С.Е. (2006) Биомаркеры: поиск ниши в культуре тканей масличной пальмы. Часть 1- закладка фундамента.Бюллетень масличной пальмы 53: 36–48.
- 43. Биллотт Н.